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河虾过敏原原肌球蛋白的基因克隆与原核表达: 2024年; 为了探寻天然原肌球蛋白的可替代物作为诊断和治疗虾类过敏的基础材料,本研究从河虾中提取总RNA,利用cDNA末端快速扩增技术克隆河虾过敏原原肌球蛋白基因的全长序列。以此序列设计表达引物,构建表达载体,最后通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组原肌球蛋白。结果显示,河虾的原肌球蛋白基因cDNA序列全长1658 bp,开放阅读框855 bp,编码284个氨基酸,预测蛋白等电点4.70,预测分子质量32.8 kDa。河虾原肌球蛋白cDNA序列已上传至GenBank数据库,登录号为OP974621。本研究成功构建河虾原肌球蛋白重组表达质粒pET-30a-TM,并用IPTG进行体外诱导表达,最佳诱导条件为IPTG浓度1 mmol/L、37℃诱导4 h。可溶性分析结果表明重组原肌球蛋白主要以可溶性形式存在于细胞破碎液的上清液中,分子质量约38 kDa。; 骆叶晴郑双艳孙耀斌陈娇刘鑫刘鑫谢彦海; 关键词：河虾原肌球蛋白基因克隆原核表达重组蛋白

大鲵金属硫蛋白AdMT基因的克隆、原核表达和蛋白纯化方法: 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及大鲵金属硫蛋白AdMT基因的克隆、原核表达和蛋白纯化方法，从大鲵肝脏中提取总RNA，并进行逆转录反应合成cDNA，进行引物设计，以逆转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应，将PCR产...; 郝林英骆建林李灿随坤宇王明波黄青青高强李泽旭华雪

木薯过氧化氢酶基因的克隆与原核表达: 2024年; 活性氧(reactive oxygen species, ROS)的动态变化在植物的胁迫应答中起到非常重要的作用。过氧化氢酶(catalase, CAT)是动植物体内维持ROS稳态平衡的关键酶之一。为了更好地研究MeCAT1的基因特性及其在木薯响应外界环境变化的作用,本研究鉴定并克隆了木薯MeCAT1基因,成功构建MeCAT1的原核表达载体。通过蛋白结构域分析发现,MeCAT1具有过氧化氢酶的保守蛋白结构域。此后经由蛋白诱导及酶活测定试验表明MeCAT1重组蛋白具有显著的CAT酶活性。本研究为进一步探究MeCAT1在木薯应对生物胁迫和非生物胁迫过程中的作用提供了一定的分子依据,有利于MeCAT1基因在木薯育种中功能的深度挖掘和创新利用。; 董亚彬白玉晶; 关键词：过氧化氢酶原核表达

天山云杉ABI5基因的克隆与原核表达活性测定: 2024年; ABI5又名植物脱落酸不敏感蛋白5(Abscisic acid-insensitive 5),作为ABA信号通路中重要的转录因子,协调参与了种子发育和萌发、植物生长、逆境胁迫等方面的调控。目前的研究多是以拟南芥为对象,而在天山云杉等木本植物上报道极少。本研究以天山云杉的cDNA为模板进行了PCR扩增,得到了天山云杉ABI5序列,经测序发现其全长为1071 bp,共编码了352个氨基酸。将ABI5基因连接pET-24a原核表达载体,得到了重组质粒pET-24a-ABI5。对IPTG浓度、诱导时间、培养基类型和孵育温度进行了优化,得到了最适培养条件为采用LB培养基,IPTG终浓度为0.2 mmol/L,20℃下诱导8 h。通过SDS-PAGE检测纯化产物发现大部分蛋白以包涵体形式存在,对部分包涵体蛋白进行了复性并利用孔雀石绿显色反应进行了活性的验证。; 范晓聪王佳琰阮晓奚雨欣杨丽吴庆飞王强; 关键词：天山云杉分子克隆原核表达包涵体复性

玉米大斑病菌支链氨基酸氨基转移酶基因的克隆与原核表达: 2024年; 支链氨基酸(Branched chain amino acid,BCAA)是生物体内重要的营养物质和信号分子,对蛋白质合成、糖代谢、氧化应激等有重要的调控作用。支链氨基酸氨基转移酶(branched-chain amino acid transaminase,BCAT)是BCAA分解代谢的关键酶,参与许多生理和病理过程。为明确BCAT对玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)生长发育和侵染的影响,克隆玉米大斑病菌BCAT基因(StBCAT1),该基因编码的StBCAT1含有保守结构域BCAT_beta_family,属于PLPDE_IV超家族,与玉米圆斑病菌(Helminthosporium carbonum)产生的寄主选择性毒素HC-toxin ToxF高度同源。为了获得大量高纯度的StBCAT1蛋白,构建该基因的原核表达载体,并转化BL21(DE3)菌株。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测,结果表明,StBCAT1基因在大肠杆菌得到高效表达,获得了预期分子量为39.2 KD的StBCAT1蛋白。; 张运峰张淑红许可高凤菊武秋颖石洪凌李艳梅范永山; 关键词：玉米大斑病菌原核表达

香蕉MaMC6的克隆及原核表达分析: 2023年; Metacaspases(MCs)是植物程序性细胞死亡的调控基因,参与植物对胁迫的响应。利用PCR技术,从巴西蕉(Musa AAA Cavendish cv.Brazil)细胞中克隆到MaMCs家族成员MaMC6,对其进行生物信息学分析、表达模式分析和功能验证。结果表明,MaMC6由320个氨基酸组成,为稳定蛋白,具有亲水性,不含跨膜结构,含有一个caspase-like domain,属于Ⅱ型metacaspase蛋白,具有一个防御和应激响应元件。RT-qPCR分析结果显示,100 mmol/L NaCl处理后MaMC6在2 h时相对表达量达到对照的7.70倍;盐胁迫下CaCl_(2)处理后,基因的表达在2 h时为对照的3.99倍;而钙离子螯合剂EGTA和钙离子通道阻碍剂LaCl_(3)的处理提高了MaMC6在盐胁迫下的表达,2 h时达到对照的9.92和11.20倍。亚细胞定位结果显示,MaMC6定位在细胞质和细胞核上。转大肠杆菌结果显示,重组菌株pET28a-MaMC6在NaCl、甘露醇和高温胁迫下生长情况优于对照菌株pET28a。综上所述,MaMC6可能参与香蕉对非生物胁迫的响应过程。本研究为进一步研究MaMCs在香蕉抗逆中的作用提供参考。; 滕梦鑫徐亚何静汪奇乔飞李敬阳李新国; 关键词：香蕉 RT-QPCR 亚细胞定位原核表达

罗氏沼虾GIH–like基因的克隆与原核表达: 2023年; 运用RT–PCR技术获得罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii) GIH–like基因的开放阅读框(ORF)序列,通过荧光定量PCR技术检测该基因在罗氏沼虾不同组织中的表达量,并运用原核表达技术诱导表达罗氏沼虾GIH–like成熟肽的重组蛋白。结果显示:罗氏沼虾GIH–like的ORF全长为339 bp,共编码112个氨基酸残基,其中包含34个氨基酸组成的信号肽及78个氨基酸组成的成熟肽,具有CHH家族Ⅱ型肽的典型特征;同源性和进化关系分析表明,罗氏沼虾GIH–like与日本沼虾GIH的同源性最高,亲缘关系最近;荧光定量PCR结果显示,罗氏沼虾GIH–like在眼柄中的表达量最高,极显著(P<0.01)高于其他组织的,在脑、神经节、心脏等组织中表达量较低;诱导表达的罗氏沼虾GIH–like重组蛋白的相对分子质量约为2.6×10^(4),除去标签蛋白后约为8.5×10^(3),与Prot Param预测的9.4×10^(3)接近。; 曾奇龙陈兆明; 关键词：罗氏沼虾原核表达重组蛋白

马泰勒虫棒状体颈部蛋白5基因的克隆与原核表达: 2023年; 从马泰勒虫新疆分离株PCR扩增棒状体颈部蛋白5(ron5)基因,构建pGEX-4T-ron5表达载体,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)进行原核表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,以谷胱甘肽S-转移酶标签兔单抗(1:2000)和马泰勒虫感染马阳性血清(1:100)作为一抗,以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和兔抗马IgG(1:5000)为二抗进行蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析。马泰勒虫新疆分离株的ron5基因长1434 bp,提交GenBank获得的登录号为OP777492。序列比对结果显示,马泰勒虫新疆分离株ron5的核苷酸和氨基酸序列与马泰勒虫WA株(GenBank登录号XM 004833657)的序列一致性最高,分别为99.6%和99.2%。系统进化树分析结果显示,马泰勒虫新疆分离株与马泰勒虫WA株聚在同一支上,二者亲缘关系最近。SDS-PAGE分析结果显示,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导3 h时,RON5的表达量最高;RON5的相对分子质量(Mr)约为79000,主要以包涵体形式表达。Western blotting分析结果显示,RON5可被谷胱甘肽S-转移酶标签抗体和马泰勒虫感染马血清识别,在Mr 79000处有明显条带。本研究克隆了ron5,表达的RON5具有较好的抗原性。; 芦星王水怡陈林军刘明明刘雨桐朱慧茹姜冰冰杜少磊巴音查汗刘丹丹张伟; 关键词：原核表达抗原性

新疆野生核桃JfDREB1A基因的克隆与原核表达分析: 2023年; 为探究DREB1A基因在新疆野生核桃响应低温胁迫中的作用及表达特性,以新疆野生核桃群体中的‘小矩圆’类型为试验材料,根据同源克隆的方法得到JfDREB1A基因的cDNA全长序列,利用荧光定量PCR检测其在低温胁迫条件下的表达水平;将该基因片段重组到pET-28a(+)原核表达载体上,转化到大肠杆菌(DE3)感受态细胞中诱导表达。结果表明,获得了新疆野生核桃中的DREB1A,将其命名为JfDREB1A,该基因的开放读码框长度为645 bp,具有典型的DREB1/CBF转录因子结构特征,JfDREB1A蛋白与其他植物DREB1蛋白具有高度保守性,与核桃亲缘关系最近。RT-PCR分析显示在4℃低温胁迫下,JfDREB1A基因的表达量迅速上调,8 h时达到最大。成功构建了pET-28a-JfDREB1A重组表达质粒,得到大小约为29 ku的融合蛋白,与预测蛋白大小相符,该蛋白在大肠杆菌中最佳诱导条件是诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol/L,诱导2 h。; 韩立群韩立群赵钰梅闯梅闯; 关键词：基因克隆原核表达

马泰勒虫棒状体颈部蛋白4基因的克隆与原核表达分析: 2023年; 【目的】克隆马泰勒虫新疆株棒状体颈部蛋白4基因(RON4)并原核表达RON4蛋白。【方法】参考美国马泰勒虫WA株基因组数据及其他顶复门原虫RON4基因信息,设计特异性引物,以马泰勒虫新疆株DNA为模板克隆RON4基因片段,构建pET-32a-RON4原核表达载体后进行原核表达与鉴定,并对RON4基因编码蛋白进行生物信息学分析。【结果】获得马泰勒虫新疆株RON4基因(NCBI登录号为:ON254212)。马泰勒虫新疆株与马泰勒虫WA株亲缘关系最近,RON4基因的核苷酸和氨基酸相似性分别为99.4%和99.0%;RON4基因在种间高度保守,其氨基酸序列与其他顶复门原虫具有高度相似的保守区域。成功构建了RON4蛋白原核表达载体,诱导表达获得分子质量为50 ku的重组包涵体蛋白;重组蛋白可与马泰勒虫阳性马血清特异性反应。生物信息学分析表明,马泰勒虫新疆株RON4蛋白的亲水性、柔韧性以及表面可及性较弱,B细胞表面抗原表位区域较少,形成表面抗原表位的结构基础条件不足。【结论】克隆获得了马泰勒虫新疆株RON4基因,并完成了原核表达及鉴定,该基因高度保守,在不同物种间可能具有相似的功能。; 芦星范士龙王水怡王金明李思媛刘明明刘雨桐巴音查汗刘丹丹张伟; 关键词：原核表达 B细胞抗原表位

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