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创伤弧菌溶细胞素噬菌体单链抗体库的构建: 2021年; 目的为获得高特异性创伤弧菌溶细胞素单链抗体,利用噬菌体展示技术建立鼠源性噬菌体单链抗体库。方法用溶细胞素蛋白免疫BALB/c小鼠后,取脾脏提取总RNA,逆转录获得cDNA。以cDNA为模板扩增出抗体的轻链和重链可变区基因片段,通过OE-PCR技术拼接成完整scFv基因片段,构建重组噬菌粒pComb3XSS-scFv,电转化到大肠杆菌XL1-Blue构建噬菌体单链抗体库。结果构建鼠源性的噬菌体单链抗体文库其重组率为78%,库容量为3×10^(8)。结论成功构建鼠源单链抗体噬菌体文库,为创伤弧菌感染的快速诊断奠定基础。; 潘振陈杰敏胡成进; 关键词：创伤弧菌噬菌体展示单链抗体

创伤弧菌溶细胞素激活血小板并参与引起脓毒症的机制研究: 创伤弧菌(Vibrio vulnificus,V.vulnificus)是一种适度嗜盐性的革兰氏阴性海洋弧菌。创伤弧菌可以感染鱼类和人类致病,人主要通过食入未煮熟的带菌海产品或伤口接触海水感染。食入性感染的患者早期会出现...; 凤梓涵; 关键词：创伤弧菌酒精性肝病脓毒症血小板; 文献传递

创伤弧菌溶细胞素膜成孔肽对巨噬细胞溶酶体和ROS水平及细胞活性的影响: 2020年; 目的研究重组创伤弧菌溶细胞素膜成孔多肽(rMpf)对小鼠J774A.1巨噬细胞株的细胞毒性作用及对活性氧簇(ROS)和溶酶体的影响,并了解其作用巨噬细胞后的胞内定位情况。方法利用大肠埃希菌表达系统表达rMpf,体外作用于小鼠J774A.1巨噬细胞株。流式细胞术分析rMpf对小鼠J774A.1巨噬细胞株的细胞毒性作用及对ROS和溶酶体的影响。激光共聚焦显微镜观察其胞内定位情况。结果低浓度(4μg/ml)rMpf作用小鼠J774A.1巨噬细胞后,其存活率、胞内ROS和溶酶体无明显变化。20和60μg/ml rMpf作用J774A.1巨噬细胞后,细胞存活率、ROS和溶酶体均明显下降。此外,rMpf能进入J774A.1巨噬细胞并定位于细胞质和细胞核,且呈剂量依赖性。结论rMpf能进入细胞质和细胞核,并且抑制胞内ROS水平、破坏溶酶体最终导致巨噬细胞功能受损。本研究为进一步了解创伤弧菌溶细胞素及类似膜成孔毒素的细胞毒性结构域功能和分子致病机制提供了实验依据。; 郑易黄显辉谢旦立楼永良; 关键词：创伤弧菌活性氧簇溶酶体细胞活性

创伤弧菌溶细胞素A蛋白疫苗对创伤弧菌感染小鼠的保护作用机制的研究被引量：1: 2018年; 目的观察创伤弧菌溶细胞素A（vibrio vulnificus hemolysinA，VvhA）蛋白免疫对创伤弧菌致死剂量感染小鼠的保护作用，并探讨其可能的免疫保护机制。方法首先表达并纯化VvhA蛋白，然后建立VvhA蛋白免疫BALB／c小鼠动物模型。通过腹腔注射致死剂量创伤弧菌感染后，连续72h观察小鼠存活率，并进行组织病理学检查以及肝功能指标检测；采用流式细胞术检测VvhA蛋白免疫BALB／c小鼠模后脾脏及腋窝和腹股沟淋巴结滤泡辅助性T细胞（follicular helper Tcells，Tfh）、GCB细胞表达。结果VvhA蛋白免疫组BALB／c小鼠72h生存率达83．3％。对照组BALB／c小鼠72h全部死亡。VvhA蛋白免疫组BALB／c小鼠主要脏器损伤显著减轻。VvhA蛋白免疫后小鼠脾脏、淋巴结Tfh细胞和生发中心（generminal center，GC）B细胞表达显著升高（P〈0．05）。结论VvhA蛋白免疫后能够显著减轻创伤弧菌致死剂量感染引发的过度炎症反应，其免疫保护机制可能是上调了Tfh和GCB细胞的表达。; 黄菲李昱刘晓斐胡成进; 关键词：创伤弧菌免疫机制滤泡辅助性T细胞

创伤弧菌溶细胞素对小鼠骨髓来源巨噬细胞坏死性凋亡的作用及机制被引量：4: 2018年; 目的探讨创伤弧菌溶细胞素(VVc)对永生化小鼠骨髓来源巨噬细胞(i BMDM)坏死性凋亡的作用及机制。方法 i BMDM细胞按照不同浓度的VVc刺激以及是否接受受体相互作用蛋白1(RIP1)特异性抑制剂Nec-1的预处理分为5组:对照组、VVc 2μg/ml组、VVc 4μg/ml组、Nec-1+VVc 2μg/ml组和Nec-1+VVc 4μg/ml组。Nec-1各组在VVc处理前1h加入5μmol/L Nec-1,实验中各组在VVc处理2h后收集培养上清及细胞。采用乳酸脱氢酶(LDH)法评价VVc对细胞的毒性情况;采用流式细胞仪检测细胞状态;采用Western blotting检测细胞焦亡和坏死性凋亡相关蛋白GSDMD(gasdermin D protein)和混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)的表达。结果培养基上清内LDH水平随VVc浓度上升而升高,且可被Nec-1预处理所抑制(P<0.05)。流式细胞检测结果显示,VVc处理后呈Annexin V/PI双标阳性的细胞比例明显增加,使用Nec-1预处理后,该比例明显下降(P<0.05)。Western blotting检测结果显示,VVc处理组p MLKL水平明显高于对照组和Nec-1+VVc处理组(P<0.05),各组均未观察到焦亡相关蛋白存在剪切体活性形式。结论 VVc可通过RIP1诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞发生坏死性凋亡。; 帅维正帅维正吴成林吴成林蒲倩王欲晓王欲晓周丽君张志成; 关键词：创伤弧菌

创伤弧菌溶细胞素特定氨基酸序列分析及其人源化单链抗体筛选: 2018年; 本研究利用生物信息学方法分析创伤弧菌(vibrio vulnificus, V.vulnificus)溶细胞素的蓖麻毒素结构域内氨基酸序列并合成多肽,筛选人工合成的单链抗体噬菌体文库Tomlinson I+J,为创伤弧菌感染的抗体阻断治疗研究奠定基础。通过对未经处理的大容量Tomlinson I+J噬菌体文库进行3轮特异性亲和筛选,从中筛到特异性结合溶细胞素多肽的克隆,命名为scFv-D2,经氨基酸序列分析验证其含有完整的人源化抗体重链和轻链可变区。将scFv-D2克隆转化E.coli HB2151并诱导表达,用ELISA方法检测其可溶性scFv片段与溶细胞素毒性多肽的结合活性。结果显示从Tomlinson I+J文库成功筛选出一株具有结合活性的人源化噬菌体单链抗体,可用于创伤弧菌感染抗体阻断治疗策略的研究。; 潘振吕鹏邵淑丽毕艳梅孙梅曲业敏陈英剑王明义胡成进; 关键词：创伤弧菌噬菌体展示单链抗体

创伤弧菌溶细胞素对不同类型免疫细胞作用差异: 目的：研究创伤弧菌溶细胞素对不同脏器中不同类型免疫细胞作用差异. 方法：体外重组表达rVVH后,体外作用于小鼠肝、脾、肺组织细胞,检测rVVH作用后细胞培养液上清中的LDH含量,流式细胞术分析rVVH对三个脏器中NK细胞...; 郑易楼永良谢旦立; 关键词：创伤弧菌脓毒症免疫细胞杀伤作用

创伤弧菌溶细胞素致病机制与机体免疫应答的研究: 目的:创伤弧菌(V.vulfinicus)溶细胞素VvhA蛋白是由V.vulfinicus的vvhA基因所编码的一种外分泌蛋白。它通过在靶细胞膜表面形成小孔发挥其生物作用,具有溶血活性和细胞毒性,既往研究认为该基因的编码...; 李昱; 文献传递

创伤弧菌溶细胞素对小鼠脾脏和肺脏T细胞细胞毒活性的差异性影响被引量：1: 2016年; 目的：研究重组创伤弧菌溶细胞素（ rVvhA）对小鼠脾脏和肺脏T细胞亚群细胞毒活性作用及其组织差异性，了解其对脾脏和肺脏CD4^＋初始T细胞和效应T细胞存活率的影响。方法利用大肠杆菌表达系统重组表达创伤弧菌溶细胞素（rVvhA），体外作用于C57BL/6小鼠的脾脏和肺脏单细胞悬液，采用流式细胞术结合CD45.2、CD4、CD8、CD44、CD62L和Live/Dead等荧光抗体（或探针）检测分析rVvhA对CD4^＋T细胞和CD8^＋T细胞的存活率及组织差异性的影响。结果 rVvhA体外作用于脾脏和肺脏的单细胞悬液6 h后，小鼠脾脏CD4^＋T细胞和CD8^＋T细胞的存活率下降且CD4^＋T细胞对rVvhA的细胞毒性更为敏感，小鼠肺脏CD4^＋T细胞存活率轻微下降而CD8^＋T细胞的存活率无明显变化，此外，脾脏CD4^＋初始T细胞和效应T细胞的存活率均下降，而肺脏CD4^＋初始T细胞和效应T细胞的存活率均未有明显下降。结论 rVvhA对脾脏和肺脏T细胞亚群细胞毒活性存在组织差异性，而这种差异性可能与组织间的CD4^＋初始T细胞有关。; 王永明高晖郑蒙蒙谢旦立楼永良; 关键词：创伤弧菌溶细胞素

创伤弧菌溶细胞素对小鼠肝脏CD4＋T细胞线粒体数量及CD62L表达的影响被引量：1: 2016年; 目的研究重组创伤弧菌溶细胞素（rVvhA）对小鼠肝脏CD4＋T细胞的细胞毒活性及其对线粒体数量和CD62L表达中的作用，了解其对肝脏不同类型CD4＋T细胞存活率的影响。方法利用大肠埃希菌表达系统重组表达创伤弧菌溶细胞素，体外作用C57BL／6小鼠的肝脏单个核细胞，采用流式细胞术结合CD4、CD44、CD62L、Live／Dead、MitoTrackerRed和JC-1等荧光抗体（或探针）检测分析rVvhA对肝脏CD4＋T细胞及其亚群的存活率、线粒体数量和线粒体膜电位的影响。结果rVvhA体外作用6h后，小鼠肝脏CIM＋T细胞的存活率下降，rVvhA对CD4＋初始T细胞和效应性T细胞均有杀伤作用，且CD4＋T细胞CD62L的表达明显下调，此外，CD4＋T细胞的线粒体数量减少，线粒体膜电位显著下降。结论重组创伤弧菌溶细胞素对CD4＋T细胞的细胞毒活性可能与CD62L表达、抑制线粒体数量和膜电位有关。; 张婷高晖李路茜郑蒙蒙谢旦立郑易楼永良; 关键词：创伤弧菌溶细胞素线粒体 CD62L

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