目的:探讨抑制环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表达对软骨细胞发育成熟的影响及其作用机制。方法:①分析温度对SV40病毒大T抗原介导永生化小鼠软骨细胞(mouse chondrocytes immortalized by SV40 large Tantigen,MCT)发育成熟的影响。将MCT在温度32℃、CO_(2)浓度8%的细胞培养箱内进行培养,待MCT汇合率至80%时,分别置于32℃下(32℃培养组)和37℃下(37℃培养组)继续培养。培养72h后,采用相差倒置显微镜观察细胞形态学变化;采用CIAS大恒细胞图像分析系统测量细胞长径、短径,并计算细胞体积;提取各复孔中MCT的RNA,逆转录后采用实时定量PCR检测MCT中COX-2、胶原蛋白α-1(X)[Collagenalpha-1(X)chain,COL10A1]的mRNA表达水平;提取各复孔中MCT的总蛋白,采用蛋白质印迹法检测MCT中COX-2、COL10A1的蛋白表达水平。②筛选COX-2抑制剂NS-398的最佳抑制浓度。将MCT在温度32℃、CO_(2)浓度8%的细胞培养箱内进行培养,待MCT汇合率至80%时,按照NS-398终浓度为0.2μmol·L^(-1)、1μmol·L^(-1)、2μmol·L^(-1)、10μmol·L^(-1)、20μmol·L^(-1)、25μmol·L^(-1)、30μmol·L^(-1)、40μmol·L^(-1)、50μmol·L^(-1)、60μmol·L^(-1)将MCT分为10个干预组,分别加入等体积不同浓度的NS-398,空白对照组加入等体积的二甲亚砜。于37℃下培养24h后,提取各复孔中MCT的RNA,逆转录后采用实时定量PCR检测MCT中COX-2的mRNA表达量,比较和筛选NS-398对COX-2表达的最佳抑制浓度。③分析NS-398最佳抑制浓度对MCT发育成熟的影响。以②中NS-398最低浓度为对照,分析NS-398最佳抑制浓度对MCT发育成熟的影响。将MCT在温度32℃、CO_(2)浓度8%的细胞培养箱内进行培养,待MCT汇合率至80%时,按照NS-398终浓度为0.2μmol·L^(-1)、40μmol·L^(-1)将MCT分为0.2μmol·L^(-1)NS-398干预组和40μmol·L^(-1)NS-398干预组,分别加入等体积不同浓度的NS-398,移至温度37℃、CO_(2)浓度8%的细胞培养箱内继续培养。培养72h后,采用①�
