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- 鹅星状病毒通用型TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
- 2025年
- 为建立用于鹅星状病毒1(GAstV 1)和鹅星状病毒2(GAstV 2)感染快速检测的实时荧光定量RT-PCR方法,试验根据部分GAstV ORF2基因和部分3′非编码区序列设计合成特异性引物和探针,采用矩阵法获得引物和探针的最优浓度,在优化退火温度的基础上,分别建立扩增GAstV 1和GAstV 2的标准曲线,进一步验证该方法的特异性、敏感性和重复性,建立的方法用于临床样品的检测,并与文献报道的常规RT-PCR方法进行比较。结果显示:优化后的反应体系中最优上、下游引物浓度均为0.40(或0.50)μmol/L,探针浓度均为0.50μmol/L,扩增线性范围分别为3.26×10^(3)~3.26×10^(8)拷贝/μL和7.09×10^(3)~7.09×10^(8)拷贝/μL,相关系数均为0.998;该方法可特异性检出两种GAstV,但对新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、鹅细小病毒和血清4型禽腺病毒6种鹅病相关病毒的核酸均无扩增信号;其检测限分别为3.26×10^(2)拷贝/μL和7.09×10^(1)拷贝/μL;组内变异系数和组间变异系数均低于3%。建立的实时荧光定量RT-PCR方法对临床样品的检测结果显示,GAstV阳性率为90.57%(96/106);而文献报道的常规RT-PCR方法对GAstV 1和GAstV 2的混合阳性率为62.26%。研究表明,建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法为同时检测GAstV 1和GAstV 2提供了快速、敏感、特异且能满足临床样本需求的检测方法。
- 陈立功穆英丽张诚潘保革潘保革魏忠华魏忠华王学静
- 关键词：荧光定量RT-PCRTAQMAN探针
- 一种牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测引物、探针及应用
- 本发明公开了一种牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT‑PCR检测引物、探针及应用。属于生物检测技术领域。包括：引物NB‑F‑4716、NB‑R‑4949和探针NBV‑TZ。本发明最佳上下游引物浓度均为500nmol/L，探...
- 周伟光赵润涛张志丹悉尼尼根王旭芬侯琳张贺赵洋
- 赤羽病病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用
- 2024年
- 为建立一种快速、灵敏的赤羽病病毒(Akabanediseasevirus,AKAV)核酸检测方法,以AKAV S基因为靶基因,设计特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应体系和条件,建立了AKAV荧光定量RT-PCR检测方法,随后开展了敏感性、特异性及重复性评估,并利用该方法与AKAV检疫行业标准推荐方法同时对临床采集的80份牛羊血液样品进行检测,以检验方法的临床应用效果。结果显示:本研究建立的检测方法敏感性较高,最低检测限为13.4 copies/μL;特异性良好,与口蹄疫病毒、牛冠状病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、牛白血病病毒等均无交叉反应;组内试验变异系数为0.93%~2.47%,组间试验为1.25%~2.76%,重复性良好;利用建立的方法从80份临床样品中检出AKAV阳性样品21份,该检测结果与AKAV检疫行业标准推荐方法的符合率为98.75%。结果表明,本研究建立的AKAV荧光定量RT-PCR检测方法敏感性高,特异性及重复性好,适用于赤羽病临床检测,为赤羽病病原学监测和诊断技术标准开发提供了技术支撑。
- 李超王素春隋金钰潘俊慧魏世萌祁倩周凯钰太王楷宬
- 关键词：赤羽病病毒实时荧光定量RT-PCR
- 猪轮状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用被引量：2
- 2024年
- 根据猪轮状病毒VP6基因序列保守区设计特异性探针和引物,建立一种特异、灵敏、通用、高效检测Po RV的实时荧光定量RT-PCR检测方法。扩增目的片段为173 bp,以构建的重组质粒p MD19-T-VP6为模板进行反应程序的优化。结果显示,该方法的标准曲线为y=-3.1139x+39.298,R^(2)=0.9937,E=109.5%;用该方法检测猪常发传染病病原时结果均为阴性;对标准品质粒的最低检测限为1.32 copies/μL;批内、批间变异系数分别小于0.600%、1.300%,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。利用该方法检测114份临床腹泻病料,阳性检出率(39/114)优于常规RT-PCR(22/114),39份阳性样品经测序鉴定均为Po RV,扩增VP7基因后成功构建22份阳性质粒,测序结果显示共检出6种G型Po RV,检出率依次为9.09%(G3)、22.72%(G4)、18.18%(G5)、31.82%(G9)、4.54%(G11)、9.09%(G26)。上述结果表明,本试验建立了一种快捷、准确检出Po RV的Taq Man探针通用型实时荧光定量RT-PCR方法,对该病的诊断、病原监测、流行病学调查具有重要意义。
- 柳佳佳梁海英曾智勇汤德元王彬叶泥边孟婷黄书田红利潘向英
- 关键词：猪轮状病毒TAQMAN探针荧光定量RT-PCR
- 帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用被引量：1
- 2024年
- 本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。
- 杨恒杨恒宋子昂高林高林廖德芳廖德芳肖雷
- 关键词：血清型鉴定实时荧光定量RT-PCR
- 蜜蜂慢性麻痹病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
- 2024年
- 为建立慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)快速诊断方法,本研究根据CBPV RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.998;该方法最低检出限为10拷贝/μL,与蜜蜂急性麻痹病毒等常见蜜蜂病毒无交叉反应,具有良好的灵敏性和特异性;组内和组间变异系数分别低于0.5%和2%,具有较好的稳定性。本研究建立的CBPV荧光定量RT-PCR检测方法,可用于实验室检测、流行病学调查和疫情监测。
- 张体银王武军林素洁张志灯李宋钰于师宇
- 关键词：荧光定量RT-PCR
- 猪流感病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立
- 2024年
- 参照GenBank登录的猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)基质蛋白(matrix protein,M)基因保守序列设计1对特异性引物和1个TaqMan探针,构建重组质粒作为绝对定量模板,通过优化反应体系及条件建立了检测SIV的荧光定量RT-PCR方法,测试了该方法的特异性、灵敏度及重复性。结果显示,建立的方法与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒等不存在交叉反应,特异性强;最低检测限度为1.0拷贝/μL,比普通RT-PCR方法灵敏10倍;组内和组间重复性试验的变异系数分别在2.2%和1.9%以下,重复性较好;应用该方法对220份临床疑似猪流感样品进行检测,荧光定量RTPCR方法和普通RT-PCR检测率分别为2.7%和1.8%,阳性符合率为100%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可快速检测样品中的各种SIV,从而更好地诊断和监测猪流感。
- 黄书梁海英曾智勇汤德元王彬叶泥边孟婷柳佳佳潘向英田红利
- 关键词：猪流感病毒TAQMAN探针荧光定量RT-PCR方法
- 新型鹅呼肠孤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立
- 2024年
- 2020年以来,在我国养鹅地区出现了一种由新型鹅呼肠孤病毒(Novel goose reovirus,NGRV)引起的以肝脾点状白色灶性坏死为主要病变特征的鹅传染性疾病。为了快速有效地检测NGRV,本试验针对禽呼肠孤病毒的λC基因设计引物和探针,建立了基于TaqMan探针荧光定量PCR方法,结果显示:该方法特异性强,对鹅细小病毒、坦布苏病毒、鹅圆环病毒、番鸭呼肠孤病毒、新型鸭呼肠孤病毒和鹅星状病毒等病原不存在交叉反应;该方法具有较高的敏感性,最低可检测限为56.6拷贝/μL,比常规PCR方法敏感10倍;该方法的重复性良好,组内和组间变异系数小于2%。对37份疑似新型鹅呼肠孤病毒病的临床样品检测结果显示,荧光定量RT-PCR和RT-PCR检测出阳性样品均为13份,两者符合率为100%。测序结果表明,13份阳性样品均为NGRV。本试验成功建立了NGRV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,为新型鹅呼肠孤病毒病的流行病学调查和防控奠定了坚实的基础。
- 董嘉文黄允真李林林张俊勤陈修邓张志宏李万荣邝瑞欢孙敏华
- 关键词：TAQMAN荧光定量RT-PCR
- 番茄环斑病毒半巢式荧光定量RT-PCR检测方法的建立
- 2024年
- 为准确高效地检测出植物样品中的番茄环斑病毒,提高检疫效率,本研究结合了巢式PCR技术和实时荧光定量PCR技术,根据番茄环斑病毒外壳蛋白基因保守区序列设计了3条特异性引物和一条TaqMan探针,成功建立了半巢式荧光定量RT-PCR检测番茄环斑病毒的方法。该方法通过两轮实时荧光PCR扩增发现只有在番茄环斑病毒侵染的植物样品中出现荧光扩增曲线,而感染TRSV、SBMV、TSWV、PDV、BPMV的植物样品和健康叶片的c DNA及对照ddH2O未检测到荧光信号,表明该方法具有良好的特异性。根据梯度稀释法测得荧光扩增信号的最低浓度为498 ag/μL植物总RNA,说明该方法灵敏度较高,且重复性良好。两套引物探针的扩增效率对比试验结果表明第一套引物探针扩增效率小于第二套引物探针扩增效率。本研究建立的半巢式荧光定量RT-PCR检测番茄环斑病毒的方法具有特异性强、灵敏度高等特点,通过两轮实时荧光PCR检测相互验证,大大降低了假阳性结果的出现,是一种准确高效的检测方法。
- 孟祥谦邹宗峰于凯王雪李金庆缪玉刚
- 关键词：番茄环斑病毒特异性灵敏度
- 马病毒性动脉炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立被引量：1
- 2024年
- 为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量RT-PCR方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的反应条件下效果最优;质粒标准品体外转录的cRNA在1.6×10^(7)拷贝/μL~1.6×10^(2)拷贝/μL时与Ct值之间呈现良好的线性关系,标准曲线方程为y=-2.68x+32.88,R^(2)=0.9927,初步建立了EAV荧光定量RT-PCR方法。采用该方法检测EAV、马焦虫、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马流感病毒,结果显示,该方法仅能特异性检测到EAV,其他病原检测均为阴性,该方法特异性强;将体外转录合成的质粒标准品cRNA 10倍倍比稀释后利用该方法检测,结果显示该方法最低检测限为1.6×10^(2)拷贝/μL,灵敏性高;重复性试验结果显示,该方法组内及组间变异系数均小于2.0%,重复性好。采用本实验建立的荧光定量RT-PCR方法和文献发表的EAV荧光定量RT-PCR方法分别对234份临床样品进行检测,两者的阳性检出率均为14.1%(33/234),两种方法的符合率为100%。本研究建立的荧光定量RT-PCR检测方法为马病毒性动脉炎的防控提供了新的技术手段和思路。
- 梁歆歆王科珂蒋刚强徐军陈凯云王艳肖媛媛白梅花刘东
- 关键词：马病毒性动脉炎ORF7基因荧光定量RT-PCR
