国家自然科学基金(30171119)
- 作品数：8 被引量：24H指数：3
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- 基因串联体的构建策略及其表达模式被引量：10
- 2006年
- 为了获取足够的DNA片段或得到基因的表达产物,常需要构建基因串联体,将目的基因按头尾相连随机串联起来,克隆入克隆载体以制备需要的目的基因片段或克隆入表达载体进行高效表达。串联的策略包括定向串联法、PCR扩增串联法、化学拼接法、同尾酶法等,不同方法构建的串联体基因表达模式也有一定差异。
- 饶贤才胡福泉
- 关键词：串联体
- 人肽抗生素hPAB-β分子的同源模建及其突变体设计
- 2003年
- 目的 :获得肽抗生素hPAB β的分子结构 ,设计其突变体。 方法 :在序列比较的基础上 ,利用同源分子对hPAB β进行同源模建 ,并以此为基础设计其突变体 ,通过PCR引入突变法获得突变体基因序列 ,将其克隆到原核融合蛋白表达质粒 pQE CP4中 ,转化JM 10 9大肠杆菌进行表达。 结果 :模建结果表明 ,hPAB β由一个α螺旋和3个 β片层构成 ,二级结构保守 ,具有两亲性结构 ;其α螺旋推测与活性寡聚体形成有关 ;Asp4带负电 ,可能通过削弱寡聚体中央微孔口处阳电荷富集区而降低目的分子的生物学活性。利用PCR成功克隆了所设计的突变体基因 ,通过构建融合蛋白表达质粒 ,实现了突变体融合蛋白在大肠杆菌中的表达。 结论 :基于分子同源模建的肽抗生素hPAB β突变体的设计、克隆和成功表达 ,为筛选肽链更短。
- 饶贤才金晓琳黎庶胡金川胡晓梅陈志瑾胡福泉
- 关键词：肽抗生素同源模建突变体
- 肽抗生素hPAB-β制备工艺中基因工程菌的改建被引量：1
- 2006年
- 目的通过重新构建新的3拷贝串联体基因工程菌phPAB-β(3)/M15,在原有肽抗生素hPAB-β制备工艺路线基础上,使发酵后目的肽的最终产量得到提高。方法重新构建含有重组质粒pQE31-hPAB-β(3)的基因工程菌M15,然后筛选出能够稳定而且高效表达目标蛋白的最佳工程菌株,进行传代稳定性分析,并明确新建工程菌中目标融合蛋白的表达形式和亲和层析的效果,最后通过相同条件下,在逐步放大的发酵规模(1L摇瓶,3.7L和10L发酵罐),与以往的3拷贝串联体工程菌phPAB-β(3)/JM109进行对比研究(湿菌产量、目标蛋白表达率),同时观察新建工程菌在10L发酵中目标蛋白的表达和遗传稳定性。结果筛选出的最佳工程菌株的目标蛋白的表达效率为34.8%,经LB培养传代10次后,点种LB(AMP、KAN)平板,生长率为100%,质粒保存率达100%。在1L摇瓶,3.7L和10L发酵罐的发酵规模下,phPAB-β(3)/M15与phPAB-β(3)/JM109一样,目标融合蛋白都以包涵体形式表达,亲和层析效果相近,目标蛋白表达率无显著性差异(P>0·05),但发酵产量大于后者,有非常显著性差异(P<0·01)。且新建工程菌在10L发酵中发酵产量达到55.15g/L,诱导表达后的第5小时,蛋白表达达到高峰,蛋白表达率为30.2%,重组质粒保存率为100%。结论新构建工程菌phPAB-β(3)/M15比起原来基因工程菌phPAB-β(3)/JM109,是更为理想且利于肽抗生素hPAB-β工业生产的基因工程菌。
- 张椿丛延广胡福泉饶贤才
- 关键词：肽抗生素发酵
- 重组人肽抗生素hPAB-β的初步纯化
- 2004年
- 目的 探索重组人肽抗生素hPAB β的纯化工艺 ,为制备高纯度、高活性的重组hPAB β奠定基础。方法 将构建的含pQE32 CP hPAB β重组质粒的基因工程菌扩大培养 ,诱导表达后所得菌体经溶菌酶法裂解 ,鉴定融合蛋白表达形式 ;以含融合蛋白的溶液作为纯化的初始样品 ,采用Ni NTAresin亲和层析柱对融合蛋白进行纯化 ,用CNBr裂解 ,利用SephadexG 5 0、Bio gelP6DG凝胶进行分子筛层析 ,利用Macro PrepHighS进行阳离子交换层析 ,对层析峰行Tris Tricine电泳分析。结果 融合蛋白以包涵体形式存在 ;亲和层析获得了纯度为 82 .6 %的融合蛋白 ,CNBr作用 2 0h可完成融合蛋白的裂解 ;目的肽经纯化后 ,纯度达 95 %以上。结论 已初步建立了重组人肽抗生素hPAB β的纯化工艺 ,并获得了高纯度的肽抗生素hPAB β。
- 胡金川汪正清胡福泉金晓琳黎庶胡晓梅朱军民黄建军陈志瑾饶贤才
- 关键词：抗生素重组蛋白纯化融合蛋白
- 人肽抗生素hPABβ重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达被引量：5
- 2004年
- 目的 构建人肽抗生素hPAB β重组质粒 ,并在大肠杆菌中进行表达 ,为大量制备hPAB β奠定基础。方法 通过PCR将hPAB β融合蛋白的CNBr裂解位点改为羟胺裂解 ,将修改的目标片段克隆到pFAST HTa质粒中 ,挑取阳性重组子 ,酶切出目标片段再亚克隆到pQE32 CP中 ,含阳性重组子的工程菌用IPTG诱导表达 ,SDS PAGE电泳分析 ,进一步以亲和层析纯化融合蛋白 ,用羟胺裂解分析。结果 构建的pFAST hPAB β重组质粒经酶切可得到约 2 30bp的片段 ,与预期大小相符 ,测序结果表明其序列正确 ;构建的pQE32 CP hPAB β重组表达质粒酶切亦可切出 2 30bp的片段 ,测序结果表明序列和阅读框均正确 ;重组表达质粒在大肠杆菌中能表达出Mr约2 7× 10 3 大小的蛋白 ,表达量约占细菌总蛋白的 4 3% ,该融合蛋白以包涵体形式存在 ,通过亲和层析可获得该蛋白 ,纯度为 80 4 % ,该融合蛋白经羟胺裂解 1h即可得到与合成肽大小相符的小肽。结论 本研究成功构建了含hPAB β重组质粒的工程菌 ,为进一步研究和大量制备hPAB β创造了前提。
- 胡金川饶贤才黎庶金晓琳汪正清胡福泉
- 关键词：抗生素类大肠杆菌质粒裂解位点
- 基因工程技术在肽抗生素制备中的应用进展被引量：7
- 2003年
- 肽抗生素是由生物体基因编码的肽类物质 ,广泛存在于自然界中 ,是生物体非特异性免疫的重要组成部分 ,具有抗菌活性强、抗菌谱广、不易产生耐药性等优点。在未来抗感染治疗中有广阔的应用前景。肽抗生素的制备是制约其开发应用的关键环节。作者对肽抗生素工程制备的有关进展进行综述 ,包括酵母、杆状病毒、大肠杆菌等表达技术在肽抗生素制备中的应用 ,以及转基因动。
- 胡金川饶贤才汪正清胡福泉
- 关键词：肽抗生素基因工程技术抗感染治疗
- 人肽抗生素hPAB-β多拷贝串联基因工程菌的筛选及发酵研究
- 2004年
- 目的 :对已构建的人肽抗生素hPAB β 1～ 8拷贝串联基因工程菌进行筛选 ,并对其优势菌株进行发酵研究 ,为hPAB β的规模生产奠定基础。 方法 :对 1～ 8拷贝串联基因工程菌的目标蛋白表达率进行比较后 ,选择 2～ 5拷贝菌进行菌产量、目标蛋白表达率、包涵体溶解性、亲和层析效果比较 ,确定最佳多拷贝菌 ;对其摇瓶条件下发酵的培养液、温度、气体条件、IPTG诱导时机、浓度及时间进行研究。 结果 :在相同条件下 ,3拷贝菌产量(3.15 3g/L)最高 ,目标蛋白表达率 (2 7.8% )接近最高水平 ,包涵体能溶解完全 ;利用亲和层析能成功捕获融合蛋白 ,后者经羟胺裂解 ,可获得相对分子质量与合成hPAB β成熟肽大小相符的小肽 ,筛选出的优势菌传代稳定 ,其最佳摇瓶发酵条件为 37℃ ,16 0r/min条件下 ,在改良M 9 CAA培养液中培养至吸光值 (A60 0 )≈ 2 .5时 ,以终浓度为10 0 μmol/L的IPTG诱导表达 5h。 结论 :确定了 3拷贝菌为最佳多拷贝菌 ,并确定了其最佳摇瓶发酵参数。
- 胡金川汪正清金晓琳黎庶谭银玲李明申晓冬张椿胡福泉饶贤才
- 关键词：肽抗生素发酵
- 承载分子PaP3.30在小分子活性肽融合表达中的应用被引量：1
- 2004年
- 目的 :筛选并克隆一个承载分子 ,研究其在肽抗生素及其他小分子活性肽融合表达中的应用。 方法 :根据肽抗生素为小分子活性肽 ,通常带正电荷的特性 ,从绿脓杆菌噬菌体 (PaP3)基因组中筛选一承载分子 ,构建其与肽抗生素hPAB β的融合蛋白表达载体 ,确认该承载分子能在大肠杆菌中融合表达肽抗生素后 ,再选择一组不同来源、不同大小、不同等电点的小肽分子作为研究对象 ,分别构建它们与承载分子的融合蛋白表达载体 ,转化大肠杆菌进行表达。根据表达情况 ,分析所选择的承载分子融合表达生物活性小肽的能力。 结果 :从PaP3基因组中成功地筛选到ORF 30编码的 1 6 2个氨基酸组成的蛋白作为承载分子 (PaP3.30 ) ;构建该承载分子与肽抗生素hPAB β的融合蛋白表达质粒pQE PaP30 hPAB β,在大肠杆菌中表达的融合蛋白占细菌总蛋白的 30 %以上 ;对所选择的不同来源 (人、蜜蜂、爪蟾、大肠杆菌 )、不同大小(相对分子质量为 70 0～5 30 0 )、不同等电点 (pⅠ 2 .9～ 1 2 )的六种小肽分子PaP3.30 ,均能实现其在大肠杆菌中高效融合表达 ,表达量为细菌总蛋白的 35 %～4 4 %。 结论 :所筛选的承载分子PaP3.30具有很强的融合表达小分子活性肽的能力 。
- 张椿胡福泉胡金川黎庶胡晓梅黄建军陈志瑾饶贤才
- 关键词：肽抗生素
