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乙型肝炎病毒x基因转染肾小管上皮细胞导致细胞凋亡的机制探讨被引量：1: 2012年; 目的:探讨乙型肝炎病毒x基因(HBx)转染人近端肾小管上皮细胞系(HK-2细胞)后对其凋亡及细胞因子分泌的影响及可能机制。方法:体外培养HK-2细胞,用分子克隆法构建pcDNA3.1/myc-HBX质粒,采用脂质体转染法瞬时转染HK-2细胞,实时荧光定量PCR(RT-PCR)及蛋白印迹法验证HBx在HK-2细胞中的表达。以未转染质粒组和转染空载质粒pcDNA3.1/myc组作为对照,显微镜观察转染HBx基因后HK-2细胞形态,RT-PCR检测各组细胞Toll样受体4(TLR4)mRNA水平,蛋白印迹法检测各组细胞TLR4的表达,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,ELISA检测细胞培养上清中白细胞介素4(IL-4)、干扰素γ(IFN-γ)水平。结果:转染pcDNA3.1/myc-HBx质粒后的HK-2细胞中HBxmRNA和蛋白表达水平明显增加,证实转染成功;转染HBx基因组细胞形态不规则,细胞状态受损;与对照组相比,转染HBx基因组TLR4的表达水平明显上调(P<0.05),凋亡细胞数量明显增多(P<0.05),细胞上清液中IFN-γ水平增加,但IL-4水平降低。结论:经构建pcDNA/myc-HBx质粒并转染肾小管上皮细胞可成功制备乙肝病毒细胞感染模型,由此导致的肾小管上皮细胞凋亡可能与HBx引起肾小管上皮细胞TLR4的表达上调有关,HBx亦能导致细胞因子分泌紊乱。; 王轩周益朱楠袁伟杰; 关键词：乙型肝炎病毒X基因肾小管上皮细胞转染 TOLL样受体4 凋亡

乙型肝炎病毒X基因对肾小管上皮细胞凋亡及免疫分子的影响被引量：2: 2013年; 目的探讨乙型肝炎病毒x基因（HBX）转染人近端肾小管上皮细胞（HK-2）后对其凋亡及免疫指标的影响。方法体外培养HK-2。用分子克隆的方法构建pcDNA3．1-myc-HBX质粒，采用脂质体转染法瞬时转染HK-2细胞。实时定量PCR和Western印迹法检测细胞中Toll样受体4（TLR4）的变化，流式细胞术检测细胞凋亡情况及细胞表面人组织相容复合物（MHC）-Ⅱ、CD40的变化；ELISA法检测细胞培养上清中IL-4、IFN-γ水平。结果与对照组相比，转染pcDNA3．1-myc-HBX质粒组凋亡细胞数量显著增多（P〈0．05）；TLR4的表达及其表面MHC-Ⅱ、CD40表达均显著上调（均P〈0．05）；其上清液中IFN-γ水平增加（P〈0．05），但IL-4水平降低（P〈0．05）。结论HBX质粒转染HK-2细胞后可引起细胞凋亡增加，促进细胞表面免疫分子的表达，最终导致细胞损伤及免疫微环境紊乱。; 王轩周益袁伟杰朱楠; 关键词：肝炎病毒乙型细胞凋亡肾小管上皮细胞 TOLL样受体4 免疫分子

Notchl受体在乙型肝炎病毒X基因介导的肾小管上皮细胞增殖、凋亡中的作用被引量：3: 2013年; 目的探讨乙型肝炎病毒x基因（HBx）转染人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞株后对其表达Notchl受体的影响，并观察Notchl受体在HBx介导的肾小管上皮细胞增殖、凋亡中的作用。方法用分子克隆的方法构建pcDNA3．1／myc—HBx质粒及pcDNA3．1／myc—Notchl质粒，转染HK-2细胞建立转染株，并应用短发夹RNA（shRNA）干扰技术沉默Notchl基因表达。将细胞分为7组：①正常培养组；②转染HBx空载质粒组；③转染HBx质粒组；④转染HBx质粒＋Notchl空载质粒组；⑤转染HBx质粒＋Notchl质粒组；⑥转染HBx质粒＋NotchlshRNA空载质粒组；⑦转染HBx质粒＋NotchlshRNA沉默质粒组。实时定量PCR和Western印迹法验证HBx转染成功，检测细胞中Notchl受体的变化，四甲基偶氮唑盐（MTT）检测各组细胞的生长抑制率，流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果HK-2细胞经转染HBx基因后可高表达HBx，NotchlshRNA在HK-2细胞中的转染效率也高达70％，基因沉默有效；转染HBx基因组细胞Notchl水平明显高于正常培养组及转染HBx空载质粒组，且该组细胞凋亡率亦明显高于正常培养组及转染HBx空载质粒组，差异均有统计学意义（14．94％4-0．32％比13．86％±0．18％、13．67％±0．54％，均P〈0．05）。转染HBx质粒＋Notchl质粒组细胞凋亡率明显低于HBx质粒＋Notchl空载质粒组，差异有统计学意义（10．10％±0．26％比14．79％±0．02％，P〈0．05），其细胞增殖抑制率亦低于HBx质粒＋Notchl空载质粒组。而转染HBx质粒＋NotchlshRNA沉默质粒组细胞凋亡率及细胞增殖抑制率均高于HBx质粒＋NotchlshRNA空载质粒组（均P〈0．05）。结论构建pcDNA3．1／myc—HBx质粒并转染肾小管上皮细胞可成功制备乙型肝炎病毒细胞感染模型，由此导致的肾小管上皮细胞生长抑制及凋亡增加可能与Notchl受体异常活化有关。; 王轩周益袁伟杰朱楠尚明花; 关键词：肝炎病毒乙型肾小管受体 NOTCHL

乙型肝炎病毒X基因对肾小管上皮细胞间质转分化的影响被引量：3: 2012年; 目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）X基因表达蛋白HBX对体外培养的人近端肾小管上皮细胞株（HK-2）细胞形态及转分化的影响。方法用分子克隆的方法构建pcDNA3．1-myc—HBX质粒，采用脂质体转染法瞬时转染HK．2细胞，Q-PCR及Western印迹法验证HBX在HK-2细胞中的表达。以未转染质粒和转染空载质粒pcDNA3．1-myc作为对照。用显微镜观察转染pcDNA3．1-myc—HBX质粒后HK-2细胞形态，用Western印迹及Q—PCR法检测细胞转分化标志蛋白α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E钙黏蛋白（E—cadherin）的表达；ELISA检测细胞上清液中白细胞介素（IL）-1、IL-6和肿瘤坏死因子仅（TNF—α）的表达。结果转染I-IBX后的HK．2细胞中存在HBX的高表达，证实转染成功。转染pcDNA3．1．myc—HBX质粒的HK-2细胞数量明显下降，细胞形态不规则，细胞状态受损；转染pcDNA3．1-myc-HBX质粒的HK-2细胞可上调E．cadherin及α-SMA表达；细胞上清液中高表达IL-1、IL-6和TNF-α（P〈0．01）。结论HBX质粒转染HK-2细胞后可引起细胞数目和形态的变化，并促进肾小管上皮细胞发生上皮间质转分化，肾小管上皮细胞周围炎性微环境的改变可能是其发生上皮间质转分化的原因之一。; 周益王轩袁伟杰朱楠; 关键词：转染肝炎病毒乙型肾小管上皮细胞转分化

Notchl信号在乙型肝炎病毒X基因介导的肾小管上皮细胞免疫活性异常中的作用被引量：4: 2013年; 目的探讨乙型肝炎病毒x基因（HBx）转染人近端肾小管上皮细胞系HK一2细胞后对其表达Notchl信号的影响，并观察Notchl信号在HBx介导的肾小管上皮细胞免疫活性中的作用。方法用分子克隆的方法构建pcDNA3．1／myc．HBx质粒及pcDNA3．1／myc—Notchl质粒，转染HK-2细胞，并应用短发卡RNA（shRNA）沉默Notchl基因表达。将细胞分为7组：①正常培养组；②转染HBx空载质粒组；③转染HBx质粒组；④转染HBx质粒＋Notchl空载质粒组；⑤转染HBx质粒＋Notchl质粒组；⑥转染HBx质粒＋NotchlshRNA空载质粒组；⑦转染HBx质粒＋NotchlshRNA沉默质粒组。实时定量PCR和蛋白印迹法检测细胞中Notchl受体的变化，流式细胞术检测细胞表面人主要组织相容性复合物（MHC）一II、CD40表达的变化，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清中白细胞介素（IL）-4、干扰素（IFN）一1水平。结果HK-2细胞经转染HBx基因后，可高表达HBx，NotchlshRNA在HK-2细胞中的转染效率也高达70％，基因沉默有效；转染HBx基因组细胞Notchl水平高于正常培养组及转染HBx空载质粒组相比，且Notchl过表达组细胞表面MHC。II、CD40表达均明显高于Notchl空载质粒组（9．69％±0．52％比4．90％±0．32％，21．56％±0．71％比15．74％-4-0．20％，均P〈0．05），其上清液中IL_4水平亦高于Notchl空载质粒组（50．2±0．6比28．1±1．2，P〈0．05），而IFN一1水平较低（11．9-4-1．7比18．8±0．8，P〈0．05）。Notchl基因沉默后上述指标结果呈相反变化。结论HBx基因转染HK-2细胞后可引起Notchl表达上调；Notchl又可促进细胞表面免疫分子的表达，并调控细胞因子分泌，最终导致细胞损伤及免疫微环境的紊乱。; 王轩周益袁伟杰尚明花包谨芳朱楠; 关键词：上皮细胞免疫分子

肾小管上皮细胞转分化类型及其在肾脏疾病进展中的作用被引量：8: 2012年; 肾小管上皮细胞作为肾脏固有成分之一,其形态和功能的正常对于维持肾脏正常的结构和功能起着十分重要的作用.肾小管上皮细胞在机体正常发育过程中以及各种生理病理条件下,可出现转分化现象,即细胞从表形到功能均发生改变.肾小管上皮细胞的转分化参与了多种肾脏疾病的发生、发展,本文旨在阐述肾小管上皮细胞的转分化现象及其在多种肾脏疾病中作用的研究进展.; 王轩袁伟杰; 关键词：肾小管上皮细胞转分化肾脏疾病

经HBx转染后的肾小管上皮细胞对T细胞激活、分化的影响被引量：5: 2013年; 目的探讨乙型肝炎病毒x基因（hepatitis B virusx，HBx）转染人近端肾小管上皮细胞系（HK－2）后其对T细胞激活、分化的影响。方法分4组：实验组（即转染HBx质粒的HK－2细胞＋CD4＋T细胞）、阴性对照组（即转染HBx空载质粒的HK－2细胞＋CD4＋T细胞）、单独培养组（即CD4＋T细胞）和空白对照组（未处理HK－2细胞＋CD4＋T细胞）。体外培养HK－2，用分子克隆的方法构建pcDNA3．1－myc—HBx质粒，采用脂质体转染法瞬时转染HK．2细胞，实时荧光定量PCR及Western印迹法验证HBx在HK－2细胞中的表达。免疫磁珠法分选健康志愿者外周血CD4＋T细胞，分别与HK－2细胞共培养，流式细胞术检测HK－2细胞共刺激分子CD40的表达、CD4＋T细胞CD40配体（CD40L）表达及细胞周期情况，ELISA检测各组细胞培养上清中Thl型细胞因子IFN-r及Th2型细胞因子IL-4水平。结果HK-2细胞经转染pcDNA3．1-myc—HBx质粒后，可高表达HBx。转染HBx基因后HK-2细胞CD40表达显著上调（P〈0．01）；与对照组相比，实验组CD4’T细胞表面CD40L表达也显著增加（P〈0．01），S期与G2／M期细胞数之和增多（P〈0．01），培养上清中IFN-1水平升高（P〈0．05），IL-4水平降低（P〈0．05）。结论肾小管上皮细胞经HBx转染后，其共刺激分子表达上调，并促进CD4＋T细胞增殖，诱导CD4＋T细胞向Thl方向分化。由此推测，乙肝相关性肾炎肾组织免疫损伤所导致病变的持续进展也可能与此因素的参与相关。; 王轩周益袁伟杰朱楠尚明花赵亚鹏王玲谷立杰; 关键词：肾小管上皮细胞共刺激分子

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国家自然科学基金(81170672)

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