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表达抑制山羊痘病毒ORF095 shRNA的山羊成纤维细胞系的建立被引量：1: 2012年; 将已经通过体外验证能够有效抑制山羊痘病毒复制的shRNA转入山羊体细胞,构建其表达细胞系.将已经通过验证能够靶向抑制山羊痘病毒ORF095基因并有效抑制GTPV的pGPU6/GFP-ORF095-siRNA-70转染山羊原代成纤维细胞,经800μg/mL G418抗性筛选7～8d后,用含200μg/mL G418和10～15ng/mL EGF的培养基进一步单克隆化并将单克隆细胞扩大、传代培养,应用RT-PCR检测及测序鉴定所构建的细胞系.结果表明:本试验获得的1株成纤维细胞系基因组含有ORF095-siRNA-70表达框架,为进一步进行体细胞克隆转基因动物的制备和RNAi体内抗山羊痘病毒的研究奠定了基础.; 赵志荀吴国华颜新敏许丹李健朱海霞崔力凡高顺平孙晓林马保华张强; 关键词：山羊痘病毒 G418 细胞系

绵羊痘病毒RPO30基因的克隆及序列分析被引量：4: 2011年; 选择羊痘病毒RNA聚合酶RPO30进行分析,为进行RNAi羊痘病毒研究,进行目的基因的初步筛选。PCR扩增RPO30基因,连入pMD18-T simple载体并转化DH5a大肠杆菌。经蓝白斑筛选挑选白斑制备质粒,经双酶切、PCR及测序鉴定。结果成功克隆了RPO30基因,克隆的SSPV RPO30基因ORF为585bp,编码193个氨基酸,阅读框内有一个HindIII酶切位点,测序结果与Gen Bank数据库中不同痘病毒毒株之间同源性存在着明显区别。进一步经过生物学软件分析表明RPO30蛋白质氨基酸4—12、18—26、50—61、68—92,176—190位之间区域形成活性中心的可能性较大,选择这些区域进行作用可能会造成该基因产物酶的失活,从而高效抑制病毒的复制。; 赵志荀吴国华颜新敏李健朱海霞孙晓林张强; 关键词：绵羊痘病毒生物信息学

山羊乳腺上皮细胞基因转染条件的优化被引量：2: 2012年; 为了优化外源基因转入乳腺上皮细胞的条件,本研究采用组织块培养法,从山羊乳腺组织中分离并获得了纯化的乳腺上皮细胞,通过染色角蛋白和测定生长曲线对其进行了鉴定和检测。然后利用电穿孔法将PEGFPC1载体导入乳腺上皮细胞,分别比较了在不同电压(120、140、160、180、200V)、不同电击时长(5、10、15、20ms)以及2株细胞(GMEC1、GMEC2)的不同代数(第1代、第3代、第5代、第9代)条件下的转染效率,并利用优化条件对山羊乳腺上皮细胞进行人β-防御素3基因转染,经过G418筛选,最终获得单克隆细胞,同时对获得的单克隆阳性细胞进行体外诱导表达,并对诱导产物进行Western blotting鉴定。结果表明,不同遗传背景的细胞对转染效率的影响较小,而第1代培养的细胞转染效率要显著高于传代细胞,乳腺上皮细胞在电压180V、电击时长15ms、电击1次的条件下转染效率最高,优化条件下转染、筛选和扩增后获得稳定表达人β-防御素3蛋白的单克隆乳腺上皮细胞。研究工作为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺特异性表达载体的检测提供参考资料。; 杜珊马保华李亮亮刘军赵晓娥张涌; 关键词：山羊乳腺上皮细胞电穿孔转染效率

山羊痘病毒RPO30基因绿色荧光蛋白质粒的构建及融合表达被引量：1: 2011年; 为了研究针对山羊痘病毒RPO30的siRNAs的干扰效果,构建了RPO30基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。通过对RPO30基因进行PCR扩增,克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切及测序鉴定;将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和RPO30基因的转录水平。结果显示,获得的目的基因片段大小与预期结果相符,该基因与Gen-Bank数据库中RPO30基因序列的同源性为97%。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,转染后第48小时,阳性细胞率达到80.1%;经RT-PCR检测,细胞内有RPO30基因的转录。证实,已成功构建了RPO30基因与EGFP基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中获得了表达。; 赵志荀吴国华颜新敏崔力凡李健朱海霞张强; 关键词：山羊痘病毒增强型绿色荧光蛋白

山羊痘病毒古浪株P32毒力蛋白的结构模拟与分析被引量：2: 2010年; 以山羊痘病毒(GPV)古浪(Gulang)株的DNA为模板,采用PCR扩增目的基因p32,应用TM-pred软件预测其跨膜结构区域,通过Threading方法建立GPVGulang株P32蛋白的3D结构,并综合亲水性、可塑性、抗原指数以及表面可能性等参数预测其B细胞抗原表位。结果表明,p32在核苷酸水平上非常保守,19株GPVp32基因的整体变异率为0.22%。GPVGulang株P32结构蛋白的三维空间结构有不同的结构区域,共由14个α-螺旋、5个β折叠、35个转角和若干无规则卷曲构成。P32蛋白呈现较规则的空间构象,其中羧基末端第286～306位氨基酸区段为跨膜区域,11～19、21、47、66、123、154、155、183、185、225、230～232、235、238、239这些氨基酸在空间上共同形成的区域极有可能是抗原表位区域。; 赵志荀吴国华颜新敏崔力凡李健朱海霞张强; 关键词：山羊痘病毒 B细胞表位

核酶在疾病基因治疗中的应用研究进展被引量：1: 2011年; 核酶是一类具有催化活性的小RNA分子,可以特异性地识别并结合目标基因mRNA,使该mRNA断裂失活,从而阻断或降低目标基因的表达,起到基因沉默的作用。此外,核酶不会对细胞基因组产生任何副作用,因此核酶作为一种既安全又有效的分子生物学工具受到越来越多研究者的关注。核酶的这一特性可用于基因治疗,针对某些病原或肿瘤的基因设计特异性核酶,并将其导入细胞以阻断或降低这些基因在细胞内的表达,最终达到抑制病原增殖、肿瘤扩散的目的。作者就近几年核酶在人类和动物疾病治疗中的应用研究进展作一综述。; 崔力凡吴国华张强; 关键词：核酶 RNA 基因治疗

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