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人源脂多糖结合蛋白单克隆抗体的筛选及初步鉴定被引量：4: 2006年; 目的制备人源抗脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体,并对该抗体的效价进行初步鉴定。方法以人脂多糖结合蛋白(human lipopolysaccharide binding protein,hLBP)为抗原,以人源噬菌体抗体库进行筛选,经5轮“吸附洗脱扩增”的富集反应后,筛选出3株抗人LBP阳性克隆株,抽提其质粒、切除geneⅢ、自身环化并电转入XL1blue后,以IPTG诱导分泌表达可溶性抗体,通过ELISA法测定抗体效价。结果抗体库被浓缩8.16×104倍,获得3个与LBP结合能力较强的单克隆菌株,其中结合力最强者产生抗体活性为106。结论成功获得针对人LBP的Fab抗体,经初步鉴定具有较高效价,为下一步研究该抗体功能奠定基础。; 邹佳葛晓冬刘友生杨艳丽; 关键词：噬菌体抗体库单克隆抗体

内毒素结合蛋白样分子p48体内外生物学活性的初步研究: 2008年; 目的以LBP为对照,对比研究p48的体内、外生物学功能。方法采用生物传感器、流式细胞分析技术研究p48与LPS及Lipid A的结合力。通过体外培养人单核细胞(U937)和小鼠体内TNF-α的分泌实验,研究p48的生物学功能。采用ELISA方法初步探索p48与LBP是否具有一定相似的空间结构。结果p48能促进LPS与PBMC结合,其活性为LBP的81%。p48能与LPS及Lipid A结合,其亲和常数(KD)分别为1.59×10-6、1.48×10-6mol/L。体内外实验中p48均能促进TNF-α的分泌,其生物学活性约为LBP的77%。高浓度抗NH-LBP Fab抗体能与p48特异性结合,p48部分空间结构与LBP可能有一定的相似性。结论p48具有与LBP相近似的生物学功能,在机体炎症反应中也发挥较重要的作用。; 葛晓冬杨艳丽段光杰陈锐潘峰朱江刘友生; 关键词：生物传感器流式细胞分析技术

改良人源LL-37杀菌肽的融合表达及其杀菌活性被引量：7: 2006年; 目的:将改良LL37多肽以融合肽形式表达、纯化,并初步研究其杀菌活性.方法:将编码改良的LL37多肽的DNA序列放入载体pET30a(+),转入工程菌BL21star(DE3)中,用IPTG诱导表达得到含6×His标记的改良融合蛋白LL37.再以TALON柱芯亲和层析、SDSPAGE和Westernblot鉴定后,用FXa裂解融合肽.将裂解后多肽进一步用强阳离子交换柱MacroPrepHighS纯化、收集各洗脱峰,脱盐、冻干.采用抑菌圈法检测改良LL37的抗菌活性.结果:改良的LL37多肽于载体pET30a(+)在杆菌BL21star(DE3)中高效融合表达,用凝胶扫描显示融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的35%.融合蛋白经纯化后用SDSPAGE鉴定在Mr4000处见单一条带.经抑菌圈法检测改良的LL37多肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很好的杀菌力.结论:改良的人源性LL37多肽以原核细胞进行融合表达是可行的,并具有较强的杀菌活性.; 杨艳丽葛晓冬刘友生邹佳; 关键词：杀菌活性

人源LL-37杀菌多肽的改建及原核细胞中表达被引量：4: 2006年; 目的改良人源杀菌肽LL-37的氨基酸序列,提高其杀菌力,并在原核细菌中表达。方法应用蛋白质分析软件(Anthepro5.0、SWISS-MODEL等),对人源杀菌肽LL-37的氨基酸序列进行二维、三维结构及理化特性分析,将其中部分氨基酸残基进行替换,提高其正电荷,并以人源杀菌肽LL-37的基因序列为模板,进行相应的DNA序列替换,转入表达载体pET-28a(+)于杆菌BL21(DE3)中表达、纯化,并初步研究其抗菌性。结果在维持LL-37空间构象不变的基础上,将Glu16、Asp26、Glu36分别替换为Gln16、Asn26、Gln36,其静电荷由pH7.4时的+5.8提高到+9.0,并且其多肽N端疏水、C端亲水的特性不变。通过Touch-Down PCR法,成功获得改良LL-37多肽的DNA序列,并将重组质粒pET-28a(+)-rLL-37在杆菌BL21(DE3)中表达,改良LL-37多肽成功由强离子交换柱芯Macro-Prep High S纯化,并对G+、G-菌具有一定的抗菌力。结论将杀菌肽LL-37多肽进行氨基酸残基替换并以原核细胞进行融合型表达是可行的,为改良LL-37的大量制备及杀菌活性研究奠定了基础。; 葛晓冬刘友生杨艳丽邹佳

人源抗NH-LBP Fab抗体的制备和初步鉴定被引量：2: 2007年; 目的构建人源抗脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)Fab抗体的原核表达载体,并制备高稳定性Fab抗体。方法用PCR方法,从可溶性表达抗NH-LBP抗体的重组质粒pComb3H-Fab中扩增出VH链和VL链基因序列,分别构建表达质粒pET-28a(+)-VH和pET-28a(+)-VL,并于工程菌BL21(DE3)star中分别表达及TALON柱芯亲和纯化,将抗体片段VH和VL共同复性,通过二硫键形成Fab抗体,再采用ELISA法初步鉴定其与NH-LBP的结合力。结果扩增出VL链和VH基因片段长约为650bp和700bp,经BL21star表达出相对分子质量(Mr)约为28000和30000的目的蛋白,共同折叠后所获得Fab抗体与NH-LBP具有较高的结合力。结论成功地制备抗NH-LBPFab抗体,为临床抗炎研究提供了条件。; 葛晓冬邹佳刘友生杨艳丽段光杰

抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段抗体dsFv V_L链的构建、表达和鉴定被引量：1: 2007年; 目的将抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)抗体的Fv L链引入半胱氨酸(Cys),并表达、纯化。方法应用mega-primer PCR方法,在抗NH-LBP单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区中引入编码Cys的基因序列,将目的序列放入载体pET-28a(+),于工程菌BL21star(DE3)中表达及TALON柱芯亲合纯化,通过ELISA法初步鉴定其与NH-LBP的结合力。结果dsFv VL链的Thr21替换为Cys,扩增出基因片段长约为650bp,经BL21star(DE3)菌表达出相对分子质量约为28×103的目的蛋白,与NH-LBP具有一定的结合力。结论抗体轻链中成功引入了Cys。; 葛晓冬邹佳杨艳丽刘友生; 关键词：半胱氨酸

改良人源杀菌肽LL-37的两种构建及表达方法的对比研究: 2006年; 目的将改良人源杀菌肽LL-37(rLL-37)用两种方法构建,并分别在原核细胞中融合表达,以寻找较好的制备方法。方法①将编码rLL-37基因序列放入载体pET-28a(+),构建表达质粒pET-28a(+)-rLL-37,并于工程菌BL21(DE3)中融合表达、纯化;②将编码rLL-37基因序列中的部分原核细菌稀有密码子替换为原核细菌偏爱密码子,并在其N端加入一段编码带负电荷的承载蛋白(carrierproteinmolecule,CPM)基因序列,构建表达质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37,并于工程菌BL21Star(DE3)中融合表达、纯化。对比上述2种方法rLL-37的制备率,并初步研究其抗菌性。结果通过Touch-DownPCR法成功获得rLL-37多肽的DNA序列,质粒pET-28a(+)-rLL-37于杆菌BL21(DE3)中表达,融合蛋白约占全菌蛋白的20%,并成功由强阳离子交换柱芯Macro-PrepHighS纯化;设计了一段含28个氨基酸残基的CPM(pHi2.7、pH7.4时电荷为-6.0),成功构建表达质粒pET-30a(+)-CPM-rLL-37,并于杆菌BL21star(DE3)中表达,融合蛋白约占全菌蛋白的35%,并被TALON亲和柱芯有效纯化。经抑菌圈实验证明两种方法所获得的rLL-37多肽对G+、G-菌都具有较好的杀菌力。结论rLL-37在原核细胞中的高效表达,为深入研究rLL-37的杀菌活性奠定了基础。; 杨艳丽葛晓冬刘友生邹佳; 关键词：LL-37

抗人氨基末端脂多糖结合蛋白二硫键稳定性Fv抗体的制备及生物学活性的初步研究被引量：1: 2008年; 目的制备抗人氨基末端脂多糖结合蛋白(N-terminal fragment of human lipopolysaccharide binding protein,NH-LBP)的二硫键稳定性Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragment,dsFv),并初步测定其生物学活性。方法将含有dsFv-VL与dsFvVH包涵体蛋白经复性、折叠和纯化,获得完整的dsFv抗体。通过ELISA、TNF-α分泌等方法,初步测定dsFv抗体在体内外的生物学活性。结果获得dsFv抗体蛋白约2.1mg,dsFv与NH-LBP有较好的结合能力,并在动物体内减轻了LPS所诱导的炎症反应,发挥了一定的保护活性。结论通过分别表达VL和VH片段,再制备dsFv抗体是可行的,dsFv能部分抑制LBP的生物学功能。; 邹佳葛晓冬杨艳丽刘友生; 关键词：包涵体

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国家自然科学基金(30400426)

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