国家自然科学基金(30400392)
- 作品数：4 被引量：9H指数：2
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Rab4蛋白参与DC细胞内源性抗原递呈被引量：4
- 2007年
- 目的建立稳定表达卵白蛋白的DC细胞株DC-OVA,研究Rab蛋白对DC内源抗原递呈的影响。方法首先构建含OVA蛋白基因慢病毒表达质粒pLentimycOVA;以DNA-磷酸钙共沉淀法转染293FT细胞制备慢病毒,用病毒感染DC2.4细胞及杀稻瘟毒素(Blasticidin)筛选方法建立稳定表达OVA的细胞株,Western blot鉴定DC-OVA细胞中OVA蛋白表达;然后用识别MHC I类分子-OVA肽复合物的T细胞杂交瘤B3Z细胞以及针对该复合物的单抗25D1.16检测DC-OVA细胞表面MHC-OVA肽复合物的形成情况,建立内源性抗原呈递的检测方法;最后采用脂质体法转染化学合成的Rab4、Rab5A、Rab7、Rab11的siRNA于DC-OVA中,B3Z检测DC内源抗原递呈的变化。结果酶切和测序分析证实转移质粒克隆成功,Western blot可在DC-OVA细胞中检测到OVA蛋白,B3Z细胞和25D1.16单抗可检测到DC-OVA细胞表面存在MHC I类分子-OVA表位多肽复合物,表明内源性抗原呈递系统成功建立。在此基础上,发现下调DC细胞中Rab4蛋白的表达,DC-OVA细胞刺激B3Z生成IL-2(白细胞介素2)的量明显下降。结论成功构建了OVA蛋白的慢病毒表达载体,获得了表达内源OVA蛋白的DC细胞株,建立了内源性抗原呈递系统,初步证实下调Rab4蛋白可抑制DC细胞的内源性抗原递呈,为病毒感染和肿瘤等疾病的治疗奠定了基础。
- 柴琳琳万瑛邹丽云张晋宇李娜刘婷李景怡吴玉章
- 关键词：OVA内源抗原递呈
- 大肠杆菌在巨噬细胞中的降解与交叉递呈研究
- 2006年
- 目的通过表达的红色荧光蛋白(DsRed)与卵白蛋白(ovalbumin,OVA)表位融合蛋白,研究表达此融合蛋白的大肠杆菌在巨噬细胞中降解与交叉递呈的时相。方法构建红色荧光蛋白与卵白蛋白表位融合蛋白的原核表达质粒(pET-16bOR),流式细胞计数仪检测表达融合蛋白的大肠杆菌,然后动态观察此大肠杆菌在巨噬细胞中的降解与交叉递呈。结果表达红色荧光蛋白(DsRed)与卵白蛋白(ovalbumin,OVA)表位融合蛋白的大肠杆菌能被488nm波长激发荧光。在巨噬细胞中,内质网与吞噬的大肠杆菌共聚;吞噬的大肠杆菌3～5h快速降解;而在此时相产生的H-2Kb-OVA257-264复合物达到顶峰。结论表达此红荧光蛋白与OVA表位融合蛋白的大肠杆菌具有荧光特性,内质网参与大肠杆菌吞噬体形成,巨噬细胞吞噬大肠杆菌后3～5h是抗原快速降解和交叉递呈的时相。
- 刘娜吴玉章周镜然邹丽云郭晟万瑛
- 关键词：红色荧光蛋白抗原递呈交叉递呈
- 红色荧光蛋白与卵白蛋白表位融合蛋白的表达与纯化被引量：5
- 2005年
- 目的构建红色荧光蛋白(dsRed)与卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)表位融合蛋白的高效表达质粒,并表达与纯化此红荧光蛋白标记的OVA模式抗原。方法合成的寡聚核甘酸变性退火成双链DNA接头,此接头含有OVA257-264表位的编码序列和一个AgeⅠ酶切位点,然后将其与dsRed蛋白编码序列克隆连接进pET16b,此表达质粒(pET-16bOR)转化大肠杆菌BL21,异丙基硫代半糖苷诱导表达后,流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的表达,并进一步经Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化,SDS-PAGE和Westernblot分析纯化的融合蛋白。结果成功构建dsRed与OVA表位融合蛋白的高效表达质粒pET-16bOR,此融合蛋白能被488nm和568nm激发荧光,此蛋白被纯化并经SDS-PAGE和Westernblot分析证实。结论红荧光蛋白与OVA表位的融合蛋白具有荧光特性,并在大肠杆菌表达、纯化,可作为进一步分析抗原递呈的模式抗原。
- 刘娜万瑛周镜然邹丽云支轶郭晟吴玉章
- 关键词：红色荧光蛋白抗原递呈蛋白表达
- 颗粒抗原交叉呈递机制的初步研究
- 2006年
- 目的以噬菌体颗粒抗原为模式抗原,研究其交叉呈递的可能机制。方法将该抗原与巨噬细胞共培养后,采用流式细胞技术和共聚焦显微镜,进行了多肽-MHC-Ⅰ类分子复合物形成的动力学研究。进而,采用流式细胞技术研究了不同蛋白酶体抑制剂以及TAP对噬菌体颗粒抗原交叉呈递的影响。结果巨噬细胞负载重组噬菌体颗粒pC89h isOVA或pC89h isHa后,细胞质MHC-Ⅰ类分子-肽复合物很快形成(约5 h);并且该颗粒抗原的交叉呈递以TAP(transport assoc iated prote in,TAP)依赖的方式进行。MG132,lactacystin以及NH4C l可以显著抑制胞内MHC-Ⅰ类分子-肽复合物的形成,而leupeptin或bestatin处理细胞却不影响该颗粒抗原的交叉呈递。结论噬菌体颗粒抗原交叉呈递是以TAP依赖的方式进行,并对多种蛋白酶体抑制剂敏感。
- 邹丽云万瑛周镜然梁云飞吴玉章
- 关键词：蛋白酶体抑制剂流式细胞仪技术
