国家自然科学基金(30540033)
- 作品数：6 被引量：52H指数：4
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- 通过引物设计和提高退火温度提高实时定量PCR检测microRNA的特异性(英文)被引量：6
- 2009年
- 目的:了解因某些microRNA(miRNA)家族成员序列相似,以及同一种成熟miRNA的长度不均一对PCR定量检测结果的影响,寻找区分相似miRNA成员和准确定量的方法和条件。方法:采用RNA加尾和引物延伸实时定量RT-PCR法,设计不同位置错配的引物,以克隆到质粒中的全长成熟miRNA为模板,比较在不同退火温度下各种错配引物与完全匹配引物在扩增miRNA上的效率差异,并根据由此得出的经验设计let-7家族成员引物,以克隆的成熟miRNA为模板,检测其在不同退火温度下区分相似家族成员的能力。此外,设计了10组3′末端碱基位置不同的特异引物,比较了它们在检测小鼠大脑miRNA表达水平上的差异。结果:提高退火温度12℃～14℃将最大限度增加特异性而不降低敏感性,将引物的3′末端置于差异碱基或其附近可以有效区分相似miRNA序列,将引物3′末端置于miRNA第18～20个碱基,可避免漏检较短的成熟miRNA,使定量更真实准确。结论:精心设计引物并提高退火温度可提高实时定量PCR检测microRNA的特异性和准确性。
- 何湘君张旗刘玉京潘秀英
- 关键词：微RNAS逆转录聚合酶链反应DNA引物
- RNA加尾和引物延伸RT-PCR法实时定量检测microRNA被引量：32
- 2007年
- 目的:用改进的RNA加尾和引物延伸RT-PCR法实时定量检测组织中的microRNAs(miRNAs),并评价其敏感性和特异性。方法:提取组织中的小于200bp的RNA,用poly(A)聚合酶在其3′末端加尾,再用5′带40nt延伸序列的单碱基锚定Olig-dT引物进行反转录,得到约80nt的cDNA,然后用特异引物进行SYBRGreen实时定量PCR扩增。结果:该法线性范围宽,可检测低丰度的miRNAs,能特异区分3′末端碱基不同的亚型,但对序列中间个别碱基不同的亚型不能鉴别。对15种miRNA在大鼠心、肝和大脑皮层的相对表达的检测验证了该法的可靠性。另外,海马组织中的miRNAs表达与大脑皮层组织有一定差异。熔解曲线的单一峰型和电泳检测到的单一条带都证明了扩增的特异性。结论:该法可快速、敏感地检测不同组织中大多数miRNAs的表达差异,可用于寻找组织特异及疾病相关的miRNAs。
- 张旗何湘君潘秀英
- 关键词：微RNAS逆转录聚合酶链反应
- MicroRNAs在唐氏综合征模型小鼠海马中的异常表达被引量：3
- 2010年
- 目的:寻找唐氏综合征模型鼠Ts65Dn和对照二倍体组小鼠海马组织中差异表达的microRNAs。方法:从小鼠的海马组织中提取小分子RNA,采用RNA加尾和引物延伸RT-PCR法检测microRNAs。通过geNorm软件和Normfinder软件分析选择最佳的内参照基因,将每种microRNAs按其引物Tm值排成阵列,用梯度实时PCR仪在不同的退火温度扩增,并计算每种相对于microRNAs内参照基因的表达量。结果:geNorm和Normfinder两种方法均选定miR-27a为最稳定的内参照基因,共检测了52种microRNAs,其中miR-33和miR-19a在Ts65Dn小鼠海马组织中表达显著下调,miR-130在Ts65Dn小鼠海马组织中表达显著上调,小鼠16号染色体三体区段包含的miR-802在Ts65Dn小鼠和对照二倍体小鼠海马组织中表达量均低,差异没有统计学意义。结论:MicroRNAs在Ts65Dn小鼠海马组织中的异常表达可能与唐氏综合征脑发育不良有关。
- 张育军何湘君刘玉京张旗
- 关键词：微RNAS唐氏综合征基因表达逆转录聚合酶链反应小鼠
- 实时定量PCR阵列检测小鼠大脑组织microRNA表达谱被引量：5
- 2009年
- 目的:分析小鼠大脑组织microRNA(miRNA)表达谱,为研究特定miRNA及其靶基因、中枢神经系统miRNA相关的调节网络,以及miRNA在中枢神经系统疾病中的作用提供参考。方法:采用RNA加尾和引物延伸序列RT-PCR法,将精心设计的特异引物按Tm值排成阵列,用梯度实时PCR仪在不同的退火温度扩增每一个miRNA,并计算出每种miRNA相对于内参的表达量。结果:共检测了285个miRNA,阳性者260个,它们丰度不同,频数分布图大致呈正态。大部分miRNA的表达水平与已发表的芯片结果一致,而阳性率高于芯片结果。源自同一miRNA前体的2个成熟miRNA表达量,有些相差无几,有些则相差甚多。同簇相邻miRNA的丰度有些相近,有些则差异明显,提示miRNA转录后的归宿决定其丰度。结论:采用实时定量PCR阵列法,分析了小鼠大脑组织的miRNA表达谱,特别是获得了一些低丰度miRNA在小鼠大脑中表达的数据,这将有助于对这些低丰度miRNA的功能研究。
- 张旗何湘君刘玉京马丽萍潘秀英
- 关键词：微RNAS逆转录聚合酶链反应小鼠
- Detection and functional annotation of misregulated microRNAs in the brain of the Ts65Dn mouse model of Down syndrome被引量：3
- 2013年
- HE Xiang-junXIAO YunZHANG QiMA Li-pingLI NaYANG Jing
- 关键词：小鼠模型功能注释WESTERN印迹法
