国家重点基础研究发展计划(2013CB967501)
- 作品数：9 被引量：13H指数：2
- 相关作者：徐国彤吕立夏李鹏范文斌王娟更多>>
- 相关机构：同济大学苏州大学附属第二医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 多能成体祖细胞培养条件促进人脂肪干细胞的视网膜神经保护功能
- 2014年
- 目的检测多能成体祖细胞(MAPC)的培养条件对猴骨髓间充质细胞(BMMSCs)和人脂肪干细胞(hADSCs)生长的影响,旨在获得更适合治疗视网膜变性疾病的供体细胞。方法通过细胞形态观察、MTT实验、克隆形成率、PCR检测、以及成脂、成骨、成软骨分化潜能检测等,研究MAPC培养条件下猴BMMSCs和hADSCs的特征,并用DMEM/LG和MAPC培养条件培养的hADSCs进行RCS大鼠视网膜下腔移植,通过视网膜电图(ERG)和TUNEL检测,判断细胞移植治疗对视功能及视网膜细胞凋亡的影响。结果与常规培养基相比,MAPC培养条件能促进猴BMMSCs增殖,细胞变小,但传2代后,细胞变得宽大扁平,出现衰老征象;然而,MAPC培养条件下的hADSCs细胞增殖能力及克隆形成率均增强,形成的克隆较大可稳定传10代以上,且具有成脂、成骨、成软骨的多向分化潜能,细胞表面标记物及细胞因子出现差异表达:CD140b、CD90、CD47、HGF和PEDF显著上调,CD73、CD105和IL-6显著下调。与对照组相比,移植DMEM/LG和MAPC培养条件培养的hADSCs(P4)3周后,RCS大鼠的B波波幅明显升高,外核层细胞凋亡明显减少。结论 MAPC培养条件培养的hADSCs显示出更好的视网膜神经保护作用,适合用于治疗视网膜退行性疾病。
- 娄慧徐国旭
- 关键词：全能干细胞视网膜变性细胞移植
- EPO修饰增强Müller细胞对RCS大鼠视网膜变性的干预效果被引量：2
- 2014年
- 目的研究人源促红细胞生成素(hEPO)修饰的Müller(hEPO-Müller)细胞对视网膜退行性病变大鼠的干预作用。方法通过质粒转染法构建hEPO和GFP的Müller细胞稳转株(hEPO-Müller和GFP-Müller);以体外共培养和体内细胞移植为研究体系,利用RT-PCR和冰冻切片及免疫荧光染色的方法检测hEPO-Müller对RCS大鼠视网膜退行性病变的干预作用。内核层与外核层厚度比较采用t检验。结果本实验成功构建了hEPO-Müller和GFP-Müller细胞系。将RCS大鼠的视网膜组织剥离并在体外不同条件下培养两周后测定视网膜各核层厚度发现,与对照细胞裂解液共培养组的内核层(15.94±1.77)μm和外核层(24.81±3.03)μm的厚度相比较,两核层的厚度分别在hEPO组为(23.03±3.29)μm,(33.92±7.59)μm(P<0.05);Müller组为(24.81±2.02)μm,(32.15±3.03)μm(P<0.05);hEPO-Müller组为(32.40±8.35)μm,(40.25±3.29)μm(n=3,P<0.01);以hEPO-Müller组厚度增加最为显著(P<0.05)。提示EPO和Müller细胞对视网膜变性都有干预作用且两者可以叠加。将hEPO-Müller和GFP-Müller分别移植到RCS大鼠的视网膜下腔,四周后取视网膜进行冰冻切片检测,染色结果显示,细胞移植后有更多的外核层细胞存活,且同样也是hEPO-Müller组的外核层细胞更多。此外,Müller移植并不会促进视网膜的胶质化。结论移植Müller细胞可以减缓RCS大鼠视网膜变性,而经hEPO修饰的Müller细胞对视网膜变性有更好的干预作用。因此,Müller细胞可以作为一种供体细胞兼携带hEPO等营养因子的载体用于视网膜变性的治疗。
- 李宗义李鹏高芙蓉范氏雪幸张敬法王方吕立夏徐国彤
- 关键词：细胞移植视网膜变性红细胞生成素MÜLLER细胞
- HSPA13在ARPE19细胞氧化应激中的作用被引量：1
- 2019年
- 目的探讨HSPA13在ARPE19细胞氧化应激中的作用。方法采用CCK8法检测不同浓度H2O2对ARPE19细胞活力的影响;Western印迹法和免疫荧光检测H2O2对HSPA13表达的影响;CCK8法检测HSPA13的表达水平对氧化应激诱导的细胞活力的影响;过表达或siRNA干扰HSPA13后,分别检测氧化应激相关指标和促炎因子的分泌;RNA测序分析空载组和HSPA13干扰组差异表达的基因,并进行GO富集及KEGG信号通路分析。结果CCK8法结果显示,与H2O2空白对照组相比,100、200、300、400μmol/L H2O2处理组细胞活力降低(P<0.05)。Western印迹法结果显示,与H2O2空白对照组相比,H2O2处理组HSPA13的表达上升(P<0.05)。CCK8法结果显示,过表达HSPA13可保护细胞活力。氧化应激相关指标和促炎因子检测结果显示,与H2O2处理组相比,过表达HSPA13加H2O2处理组中SOD1和GPX1 mRNA表达上升,MDA含量降低,GSH含量上升,IL-8、IL-2和IL-1β分泌下降;而siRNA干扰HSPA13加H2O2处理组的结果则相反,并且活性氧类含量上升(P<0.05)。RNA测序结果显示,与空载组相比,HSPA13干扰组差异基因表达上调的有64个,下调的有254个。GO富集分析表明,HSPA13与细胞代谢或多种生理过程相关。KEGG分析显示,HSPA13与PI3K-Akt信号通路、TGFβ信号通路相关。结论氧化应激诱导ARPE19细胞中HSPA13的表达上调;HSPA13在细胞氧化损伤中发挥保护作用,这为寻找年龄相关性黄斑变性新的治疗靶点提供有益的线索。
- 李梦雯吕亚莉徐国彤徐国彤
- 关键词：过氧化氢氧化应激视网膜色素上皮细胞年龄相关性黄斑变性
- 转录因子诱导人脐带间充质干细胞转分化为视网膜色素上皮样细胞的研究被引量：4
- 2015年
- 目的探讨采用关键转录因子将人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-M SCs)转分化为视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)样细胞的方法。方法通过流式细胞技术鉴定h UC-MSCs的表面标记分子;通过诱导h UC-MSCs分化成为脂肪、骨和软骨细胞确定其多系分化能力;采用慢病毒包装系统获得分别含有11个转录因子Sox2、Pax6、Rax、Six6、Nr2e1、Otx2、Lhx2、Crx、Mitf-A、Klf4和c-Myc的病毒,并通过感染h UC-MSCs来诱导h UC-MSCs向RPE样细胞分化。结果 h UC-MSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,但不表达CD11b、CD34,CD45和HLA-DR等分子标记,在成脂、成骨、成软骨分化培养基中可分化为脂肪、骨和软骨细胞。视网膜及RPE发育相关的关键转录因子能够将h UC-MSCs直接转分化为RPE样的细胞,并表达ZO-1、RPE65、Bestrophin-1(Best-1)、CK8/18、Cralbp、Mertk、Tyrosinase(Tyr)、PEDF等RPE细胞的特征分子。结论视网膜及RPE发育相关的关键转录因子可直接将h UC-MSCs分化为RPE样细胞。
- 王丽范文斌吕立夏李鹏田海滨徐国彤
- 关键词：人脐带间充质干细胞视网膜色素上皮细胞视网膜变性疾病
- 氧化应激诱导的大鼠Müller细胞微小RNA表达谱的初步研究
- 2015年
- 目的研究在氧化应激条件下视网膜Müller细胞的miRNA表达谱,为寻找氧化应激条件下Müller细胞的靶向分子提供线索。方法用2 mmol乙二醛处理大鼠Müller细胞48 h,然后收集细胞,抽提总RNA,本研究采用小RNA两端加接头序列,反转录,克隆,随机测序的方法构建大鼠Müller细胞系的小RNA文库,序列经Genebank Blastn和miRBase比对分析,M fold软件在线预测二级结构验证miRNA,经qRT-PCR鉴定miRNA,通过miRPath分析müller细胞表达的miRNA相关信号通路。结果本文库获得163个有效序列,31个克隆为已知miRNA序列,代表13种miRNA,它们与PI3K-AKT,M APK,细胞外基质的合成及相互作用等多条信号通路密切相关。发现1个新miRNA序列。结论氧化应激条件下表达的miRNA为更好地了解在生理和疾病条件下的Müller细胞功能提供有益的线索。
- 张介平郑莉王娟吕立夏徐国彤
- 关键词：氧化应激微小RNAMÜLLER细胞
- 人视网膜色素上皮细胞脱分化模型的建立被引量：1
- 2014年
- 目的建立人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞脱分化的模型,体外模拟增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)中RPE的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程。方法将ARPE-19细胞培养在无血清、含N2和NEAA的petri dish中,建立RPE的EMT模型,采用倒置荧光显微镜观察细胞形态的转变,采用基因芯片和定量PCR来检测EMT相关基因的表达,采用Western blotting和ELISA来检测相关蛋白的表达。结果 ARPE-19细胞在建模后形态明显发生了改变,基因芯片和Q-PCR检测显示一些与EM T相关的因子(如TGF-β1,Vimentin,CD46)及炎症因子(IL-15)和细胞因子(EGF)的表达上调,ELISA在蛋白水平上显示建模后细胞表达的TGF-β1,IL-15,和EGF蛋白明显增多,Western blotting显示Vimentin蛋白的表达也显著上调。结论 ARPE-19在N2和NEAA的petri dish中培养可以诱导EMT的发生。
- 王敏利吕立夏徐国彤
- 关键词：上皮-间质转变视网膜色素上皮细胞增生性玻璃体视网膜病变
- 微小RNA在视网膜中的表达及其与视网膜疾病的关系被引量：2
- 2013年
- 微小RNA（microRNA.miRNAs）是一类调控基因表达的非编码小RNA.miRNA的表达具有组织特异性,并参与细胞生长、发育、分化、增生以及凋亡等过程.近年来,人们也发现miRNA在视网膜不同细胞中呈特异表达,尽管尚无直接证据,但这些差异表达的miRNA可能与视网膜疾病如视网膜色素变性以及糖尿病视网膜病变的发生发展有着密切的联系.本文对miRNA在视网膜中的特异表达以及miRNA在视网膜疾病中的作用等研究现状进行总结,同时对miRNA在视网膜相关疾病的治疗方面的前景进行探讨.
- 靳晓亮吕立夏徐国彤
- 关键词：MIRNA视网膜新生血管形成视网膜色素变性
- Src激酶抑制剂CGP77675对TGF-β1诱导的视网膜色素上皮细胞上皮-间质转化的抑制作用被引量：2
- 2018年
- 目的探讨Src激酶抑制剂CGP77675（CGP）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人视网膜色素上皮（RPE）细胞上皮－间质转化（EMT）过程的作用及其机制。
方法将培养的人RPE细胞株（ARPE19）分为对照组、TGF-β1处理组和TGF-β1＋CGP处理组，并根据分组用相应药物处理细胞。细胞体外培养后3 d于光学显微镜下观察各组细胞的形态变化；分别采用实时荧光定量PCR法、Western blot法和免疫荧光染色法检测各组细胞中EMT相关基因及其蛋白的表达变化，包括细胞中纤溶酶原激活物抑制蛋白-1（PAI1）和纤连蛋白-1（FN1）的相对表达量及上皮细胞中闭锁小带蛋白1（ZO1）和细胞骨架蛋白F-肌动蛋白（F-actin）的分布；采用MTT法检测各组细胞的增生率；采用划痕试验检测各组细胞的迁移能力。
结果对照组ARPE19细胞呈上皮样形态，F-actin和ZO1沿细胞膜表达；TGF-β1处理组细胞为纤维样，F-actin表达的排列紊乱，细胞膜上ZO1表达不连续。TGF-β1＋CGP处理组细胞维持上皮样形态，F-actin和ZO1表达清晰且完整。对照组、TGF-β1处理组和TGF-β1＋CGP处理组细胞中FN1 mRNA和PAI1 mRNA相对表达量总体比较差异均有统计学意义（F＝33.14、82.92，均P〈0.01），对照组细胞中FN1 mRNA和PAI1 mRNA相对表达量为0.211±0.080和0.116±0.073，TGF-β1＋CGP处理组细胞中FN1 mRNA和PAI1 mRNA相对表达量分别为0.368±0.097和0.362±0.048，均明显低于TGF-β1处理组的1.000±0.001和1.000±0.001，差异均有统计学意义（均P〈0.05）。3个组细胞中FN1和PAI1蛋白相对表达量总体比较差异均有统计学意义（F＝181.90、48.85，均P〈0.01），对照组细胞中FN1和PAI1蛋白相对表达量分别为0.166±0.055和0.327±0.066，TGF-β1＋CGP处理组FN1和PAI1蛋白相对表达量分别为0.143±0.030和0.260±0.077，均明显低于TGF-β1处理组的1.000±0.001和1.000±0.001，差异均有统计学意义（均P〈0.05）�
- 何建锋吕立夏罗俊杰李宗义沈俊慧徐国彤高芙蓉
- 关键词：上皮-间质转化视网膜色素上皮细胞增生性玻璃体视网膜病变
- miR-124对Müller细胞转分化机制的影响被引量：1
- 2016年
- 目的探讨过表达miR-124对Müller细胞转分化机制的影响。方法构建p Super-EGFP-miR-124质粒并测序验证,获得miR-124的过表达载体。并用其转染Müller细胞系,用G418进行筛选,获得Müller细胞稳转株,将样本送基因芯片检测。利用Target Scan和miRBase Targets数据库预测差异表达明显的miR-124靶基因,通过Real-Time PCR和荧光素酶活性测定实验验证分析miR-124的靶基因,筛选变化比较显著的基因进一步研究。miR-124转染Müller细胞,提取mRNA和蛋白,采用Real-Time PCR、Western印迹法检测相关基因的变化。结果成功构建p Super-EGFP-miR-124质粒并获得了稳定转染的Müller细胞系。荧光素酶报告分析表明,miR-124与STAT3 3'UTR相互作用。体外结果显示,p Super-miR124转染Müller细胞后,STAT3表达下降并开始表达光感受器细胞标志物CRX和RCVRN。结论 miR-124可能通过下调STAT3,上调CRX和RECVN,诱导Müller细胞向感光细胞转分化。
- 范文斌张介平王娟吕立夏徐国彤
- 关键词：STAT3MÜLLER细胞转分化
