上海市科委“登山计划”(064119543)
- 作品数：8 被引量：14H指数：3
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- 两种fins-样络氨酸激酶受体-1基因片段对磷脂酰肌醇-3激酶／蛋白酶B之间信号通路的影响
- 2010年
- 目的 观察可溶性fms-样络氨酸激酶受体-1（sFlt-1）基因胞外第2～3区和2～4区对缺氧、高糖环境下视网膜血管通透性及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白酶B（PI3K/Akt）之间信号通路的影响.方法 构建真核表达质粒编码增强型绿色荧光蛋白质粒（pcDNA3.1-EGFP）/s Flt-1（2～3）和pcDNA3.1-EGFP/s Flt-1（2～4）,采用酶切、电泳及基因测序鉴定.将实验分为正常对照组、缺氧组和高糖组进行.以羧甲基化匍聚糖（CMD）纳米磁颗粒为基因载体,分别携带两种重组质粒转染缺氧、高糖条件下培养的人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）.采用分光光度计检测各组兔视网膜血管对伊凡思蓝（EB）染料的渗漏量.逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫蛋白印迹（Western blot）法分别检测各组细胞PI3K/Akt信号通路下游特异性磷酸化激酶Akt（p-Akt）mRNA和蛋白的表达.结果 缺氧组和高糖组注射转染细胞上清液后,视网膜血管EB渗漏量较正常对照组明显增加（t=2.476,2.515;P值均＜0.01）.缺氧组和高糖组转染了pcDNA3.1-EGFP/sFlt-1（2～3）和pcDNA3.1-EGFP/sFlt-1（2～4）后,视网膜血管EB渗漏量较未转染明显降低（t=2.598,2.679,2.386,2.732;P值均＜＜0.01）.缺氧组、高糖组HUVEC p-Akt mRNA表达较正常对照组明显上调（t=2.612,2.545;P值均＜0.01）,转染pcDNA3.1-EGFP/sFlt-1（2～3）和pcDNA3.1-EGFP/sFlt-1（2～4）后明显下调（t=2.512,2.189,2.372,2.687;P值均＜0.01）.缺氧组和高糖组HUVEC p-Akt蛋白表达较正常对照组明显上调（t=2.376,2.712;P值均＜0.01）,转染pcDNA3.1-EGFP/sFlt-1（2～3）和pcDNA3.1-EGFP/sFlt-1（2～4）后明显下调（t=2.259,2.391,2.399,2.413;P值均＜0.01）.结论 sFlt-1受体胞外第2～3区和2～4区均可抑制缺氧、高糖环境下的视网膜血管通透性增高和PI3K/Akt通路的信号传导.
- 吴强江丹宋蓓雯张敏杜新华贾丽丽
- 关键词：血管内皮生长因子受体11-磷脂酰肌醇3-激酶基因转移技术
- 缺氧和高糖对视网膜色素上皮细胞增生及VEGF、TGF-β1表达的影响被引量：3
- 2009年
- 目的探究缺氧、高糖环境对体外培养的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞生长、增生及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)表达变化的影响。方法采用酶消化法进行C57小鼠RPE细胞的体外原代培养。通过组织形态学观察和免疫化学染色对培养的RPE细胞进行鉴定。实验缺氧组:在DMEM培养液中加入CoCl2,使其浓度分别为50μmol.L-1、100μmol.L-1、200μmol.L-1;实验高糖组:在DMEM培养液中加入D-葡萄糖,使其浓度分别为15mmol.L-1、30mmol.L-1、45mmol.L-1。分别向培养的RPE细胞中加入上述培养液,共6组,每组3份;正常对照组加入含5.5mmol.L-1葡萄糖、不含CoCl2的培养液。观察各组细胞在不同培养条件下的活力、倍增时间及增生情况。采用ELISA法检测各组细胞在培养不同时间后(24h、48h、72h)上清液中VEGF及TGF-β1表达量的变化。结果原代培养及传代早期的RPE细胞生长较为旺盛;在缺氧和高糖培养条件下所培养的细胞活力和分裂次数均较正常对照组有所降低或减少,而倍增时间较正常对照组延长。在缺氧和高糖培养条件下培养24h、48h、72h后,细胞上清液中VEGF和TGF-β1表达量均较正常对照组高(P<0.05);当CoCl2浓度为100μmol.L-1和D-葡萄糖浓度为30mmol.L-1时,VEGF和TGF-β1在24h、48h、72h表达均高于其他浓度,缺氧状态下48h表达量分别为(43.28±0.88)ng.L-1和(8.90±1.38)ng.L-1,高糖状态下分别为(39.76±0.56)ng.L-1和(8.81±0.92)ng.L-1;缺氧组2种细胞因子表达量在48h达到高峰,而高糖组在72h达到高峰。结论应用酶联合消化法可获得纯度较高的体外C57小鼠培养RPE细胞;缺氧和高糖状态可对RPE细胞增生起到明显抑制作用,但能够明显上调RPE细胞的VEGF、TGF-β1表达量。
- 江丹吴强宋蓓雯贾丽丽杜新华
- 关键词：视网膜色素上皮细胞缺氧高糖
- 两种磁性纳米颗粒介导人sFIt-1基因片段转染的比较被引量：1
- 2009年
- 目的：比较羧甲基化葡聚糖（carboxymethylated dextran，CMD）与聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）纳米磁颗粒作为基因载体对可溶性血管内皮生长因子受体-1（soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFIt-1）胞外第2—3区sFIt-1（2-3）基因片段转染的差异。方法：通过磁颗粒载体将构建的真核表达质粒pcDNA3.1／sFIt-1（2—3）的基因片段转染入人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）中，检测各组的转染效率和对细胞增殖能力及凋亡的影响。实验分为CMD磁颗粒（CMD—MAG）组、PEI磁颗粒（PEI—MAG）组、单纯PEI组和未转染对照组，用第3～5代处于对数生长期的HUVEC为转染对象。在相同外界磁场条件下分别以N／P（聚合物中的氨基基团与DNA中磷酸基团的摩尔比）为10，15，20，25，30的PEI／DNA／CMD—MAG复合物、PEI／DNA／PEI—MAG复合物转染HUVEC，并以不加磁场下单纯PEI／DNA复合物转染的和未经转染的HUVEC作为对照。24h后倒置相差荧光显微镜、流式细胞仪检测以上述不同方法转染了增强型绿色荧光蛋白质粒（pcDNA3．1－EGFP）的细胞绿色荧光表达百分率以反映目的基因片段sFIt－1（2—3）的转染率；RT—PCR法和Western blot法检测转染pcDNA3．1／sFIt－1（2—3）后sFIt－1（2-3）mRNA和蛋白的表达。通过MTT法观测各组细胞的生长情况，计算各组细胞的相对增殖百分率；通过Ho—echst染色法观察各组细胞的凋亡百分率，以此对比不同磁颗粒载体转染后对细朐的影响。结果：在N／P为20时，各组GFP的转染率最高，且CMD磁颗粒组各N／P时转染率均高于其他组；转染pcDNA3．1／sFIt-1（2-3）后24h，CMD—MAG组sFIt-1（2-3）的mRNA和蛋白的表达均明显高于其他组；CMD磁颗粒转染组细胞增殖能力与对照组无明显差异，而PEI磁颗粒组、PEI组转染组细胞增殖能力均明显降低；CMD磁颗粒转染组约有5％细胞发生凋亡，PEI磁颗粒组�
- 江丹吴强宋蓓雯杜新华贾丽丽
- 关键词：受体-1
- 可溶性fms-样酪氨酸激酶受体-1不同基因片段对视网膜新生血管的抑制作用被引量：3
- 2010年
- 目的 观察可溶性fms-样酪氨酸激酶受体-1（sFlt-1）不同基因片段对小鼠视网膜新生血管（RNV）的抑制作用.方法 构建携带sFlt-1（2～3）、（2～4）免疫球蛋白样区域编码基因的重组慢病毒sFlt-1（2～3）和sFlt-1（2～4）.鼠龄7 d的C57/6J小鼠96只,数字表法随机分为4组,每组24只.1组为正常对照组;2组为模型对照组;3组为sFlt-1（2～3）组;4组为sFlt-1（2～4）组.2、3、4组置于（75±2）%氧浓度环境,出生后12 d再置于正常空气下饲养,并分别玻璃体腔注射空病毒、慢病毒sFlt-1（2～3）和sFlt-1（2～4）各1μl.出生后17 d,荧光素灌注造影行视网膜铺片,观察视网膜血管改变;视网膜切片行苏木精-伊红染色,计数小鼠RNV细胞核数;蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测视网膜血管内皮生长因子（VEGF）和VEGF受体-2含激酶插入区受体/胎肝激酶-1（KDR/Flk-1）的蛋白表达.结果 出生后17 d,与2组比较,3、4组视网膜荧光渗漏面积、RNV、突破内界膜（ILM）的血管内皮细胞核数均明显减少（P〈0.01）;VEGF蛋白表达无明显变化（P〉0.05）,KDR/F1k-1蛋白表达明显下降（P〈0.01）.结论 sFlt-1（2～3）和sFlt-1（2～4）基因片段能明显抑制氧诱导小鼠RNV的形成,sFlt-1（2～3）效果更为显著.
- 张敏吴强宋蓓雯贾丽丽陆斌杜新华
- 关键词：基因转移技术
- 携带sFlt-1基因片段的慢病毒载体的构建及表达被引量：2
- 2009年
- 目的分别建立携带可溶性血管内皮生长因子受体-1(sFlt-1)不同基因片段的慢病毒表达质粒,为进一步研究sFlt-1不同基因片段表达的蛋白生物学功能奠定基础。方法以人新鲜胎盘组织提取的cDNA为模板,进行RT-PCR扩增,制备sFlt-1基因片段sFlt-1(2-3)和sFlt-1(2-4)。扩增片断经限制性内切酶BamHI和SalI双酶切后,插入慢病毒载体pRRL-GFP中,构建慢病毒表达质粒pRRL/sFlt-1(2-3)及pRRL/sFlt-1(2-4),与慢病毒包装载体pMDLg/pRRE、包被载体PRSV/REV、pMD2.G共转染人胚肾细胞(HEK293T),获得重组慢病毒Lenti.sFlt-1(2-3)及Lenti.sFlt-1(2-4),并感染人视网膜色素上皮(RPE)细胞,通过RT-PCR和Western blotting验证Lenti.sFlt-1(2-3)及Lenti.sFlt-1(2-4)在人RPE细胞的表达。结果经酶切鉴定及基因测序证实pRRL/sFlt-1(2-3)和pRRL/sFlt-1(2-4)的序列与GenBank中的序列完全一致,并且包装成病毒后能有效感染人RPE细胞。结论本实验成功构建了分别携带sFlt-l基因第2-3和第2-4免疫球蛋白样区域编码序列的慢病毒载体,包装成病毒后能有效感染人RPE细胞。
- 吴强张敏宋蓓雯贾丽丽杜新华江丹
- 关键词：SFLT-1慢病毒载体视网膜新生血管基因治疗
- sFlt-1基因片段对缺氧、高糖下人脐静脉血管内皮细胞及ERK1/2信号通路的影响
- 2010年
- 目的比较可溶性血管内皮生成因子受体1(sFlt-1)胞外第2～3区和第2～4区对缺氧、高糖条件下血管内皮细胞增生、迁移及细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK 1/2)信号转导通路的影响。方法以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人胎盘组织cDNA文库中扩增出sFlt-1胞外第2～3区和第2～4区,连接入pcDNA3.1载体后电泳,并进行测序鉴定;以羧甲基化葡聚糖(CMD)纳米磁颗粒为基因载体分别携带2种重组质粒,转染人脐静脉内皮细胞(UVECs)后分别进行正常、缺氧和高糖条件下的培养。MTT法检测各组人UVECs的增生;光学显微镜下观察人UVECs的迁移;Western blot法检测各组人UVECs ERK1/2信号通路下游特异性磷酸化激酶ERK 1/2(p-ERK 1/2)蛋白的表达。结果经过pcDNA3.1/sFlt-1(2-3)或pcDNA3.1/sFlt-1(2-4)转染的人UVECs在缺氧和高糖条件下的增生、迁移及p-ERK 1/2蛋白的表达较转染前均明显下降(P<0.01);2种重组质粒对缺氧和高糖条件下人UVECs增生、迁移及ERK 1/2信号转导通路的影响差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 sFlt-1受体胞外第2～3区和第2～4区均可抑制缺氧和高糖条件下人UVECs的增生、迁移及ERK1/2信号通路的转导,且2种受体基因片段的作用无明显差异。
- 江丹吴强宋蓓雯张敏杜新华贾丽丽陆斌
- 关键词：增生
- 羧甲基葡聚糖磁性纳米颗粒与脂质体介导人可溶性fms-样酪氨酸激酶受体-1的转染比较被引量：2
- 2010年
- 目的 比较羧甲基化葡聚糖（CMD）磁性纳米颗粒与脂质体LipofectamineTM2000对人可溶性fms-样酪氨酸激酶受体-1（sFlt-1）第2～4区基因片段的转染率.方法 构建真核表达质粒编码增强型绿色荧光蛋白质粒（pcDNA3.1-EGFP）/sFlt-1（2～4）,采用酶切、电泳及基因测序鉴定.将实验分为磁颗粒组、脂质体组和未转染对照组进行.转染后24、48 h,倒置相差荧光显微镜下观察细胞绿色荧光分布;流式细胞仪检测细胞绿色荧光表达率;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法和免疫蛋白印迹（Western blot）法检测sFlt-1（2-4）mRNA和蛋白表达;噻唑蓝（MTT）比色法观测细胞生长情况,计算各组细胞相对增长率（RGR）;Hoeehst细胞核染色法观察各组细胞凋亡情况.结果 重组质粒pcDNA3.1/sFlt-1（2～4）酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时出现大小为915碱基对的条带.流式细胞仪检测发现,磁颗粒组平均转染率为45%,脂质体组平均转染率21%;二者比较,差异有统计学意义（t=2.541,P〈0.05）.RT-PCR和Western blot观察发现,转染后48 h磁颗粒组细胞sFlt-1（2～4）mRNA和蛋白表达均明显高于脂质体组（t=2.454,2.398;P值均〈0.05）.转染后24、48 h,磁颗粒组RGR与未转染对照组间差异无统计学意义（t=1.436,P〉0.05）,脂质体组RGR与未转染对照组及磁颗粒组间差异均有统计学意义（t=2.412,2.545,P值均〈0.05）;磁颗粒组细胞凋亡率与未转染对照组间差异无统计学意义（t=1.436,P〉0.05）,与脂质体组间差异有统计学意义（t=2.236,P〈0.05）.结论 CMD磁性颗粒较脂质体LipofeetamineTM2000可获得更高的sFlt-1（2～4）基因片段转染率.
- 江丹吴强贾丽丽宋蓓雯杜新华
- 关键词：葡聚糖类脂质体基因转移技术血管内皮生长因子受体1
- 慢病毒介导sFlt-1基因转移抑制视网膜新生血管的实验研究被引量：3
- 2010年
- 目的研究可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)对小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法将54只C57/6J小鼠随机分为3组,每组18只。将其中2组小鼠于生后第7天开始置于体积分数75%氧环境中,5d后返回正常空气环境中以建立氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型,于17d时玻璃体腔内分别注射1μLlenti-GFP和携带sFlt-1基因片段的重组慢病毒,设为模型对照组和lenti.sFlt-1组,18只正常空气环境中生长的小鼠玻璃体腔内注射1μL磷酸盐缓冲液,设为正常对照组。通过小鼠眼球连续切片苏木精-伊红染色和心脏荧光素灌注视网膜铺片法观察小鼠视网膜新生血管的变化情况,采用免疫组织化学染色法检测视网膜血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF受体-2(KDR/Flk-1)的表达变化。结果经RT-PCR扩增的靶基因片段序列与GenBank中的标准序列相吻合。感染后的人RPE细胞能够表达sFlt-1蛋白。正常对照组小鼠视网膜内界膜平整,模型对照组小鼠突破内界膜血管内皮细胞核的数目为(47.26±6.76),而lenti.sFlt-1组为(5.21±1.93)个,差异有统计学意义(P<0.05)。视网膜铺片可见新生血管荧光素渗漏表现。慢病毒携带的sFlt-1基因片段转移至模型小鼠视网膜后,发现突入玻璃体腔的血管内皮细胞核数较模型对照组显著减少,并且视网膜毛细血管扩张、微血管瘤样改变、新生血管等荧光素渗漏表现亦明显减少;同时lenti.sFlt-1组VEGF的表达与模型对照组相比在视网膜神经节细胞层和内核层仍呈现强阳性染色,无明显变化,而KDR/Flk-1的阳性染色显著减少。结论慢病毒介导sFlt-1基因转移能显著抑制小鼠视网膜新生血管的发生。
- 张敏吴强贾丽丽宋蓓雯陆斌杜新华
- 关键词：基因转移视网膜新生血管慢病毒
