国家自然科学基金(31060336)
- 作品数：3 被引量：3H指数：1
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- 正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证
- 2011年
- 【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群(Contigs),经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框(ORF),其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列(ESTcontig110和ESTcontig133)进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列ESTcontig110和ESTcontig133的预期扩增片段(ORF)与实际扩增片段(ORF)基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对ESTcontig133的ORF序列(猪的60S核糖体蛋白L18a亚基)进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。
- 李晓宁苏丽娟尹珊李晓泉章民李延生孙石开蔡新斌杨坚罗廷荣
- 关键词：外周血淋巴细胞电子克隆
- 猪STAT-1α基因的原核表达及其多克隆抗体制备被引量：1
- 2014年
- 【目的】通过制备STAT-1α多克隆抗体,为进一步研究STAT-1α蛋白的功能特性及探索STAT-1α与猪瘟病毒间的相互作用机制奠定基础。【方法】利用RT-PCR从猪肾PK-15细胞中克隆出STAT-1α基因保守片段,与pET-32a(+)构建原核表达重组质粒,转化原核宿主菌(Rosetta),进行IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经纯化和复性浓缩后,免疫小鼠制备STAT-1α多克隆抗体。【结果】STAT-1α基因能与原核表达载体pET-32a(+)构建原核表达重组质粒pET-STAT-1α,转化大肠杆菌Rosetta后的最佳体外诱导条件是IPTG 0.5 mmol/L、诱导时间6 h,其重组蛋白主要以包涵体的形式表达。STAT-1α多克隆抗体具有高效特异性,与真核细胞PK-15细胞作用后,在PK-15细胞内能检测到STAT-1α蛋白表达,可观察到大部分细胞胞浆内有绿色荧光,但胞核内几乎无荧光,即STAT-1α主要定位在正常PK-15细胞的细胞浆内表达。【结论】制备获得的猪STAT-1α多克隆抗体特异性好,既能与原核细胞大肠杆菌(Rosetta)表达的STAT-1α反应,又能与真核细胞PK-15的STAT-1α发生反应。
- 李延生刘诚张珂李晓宁李晓泉尹珊谢琳娟何晓霞罗扬钟桃珍罗廷荣
- 关键词：原核表达多克隆抗体
- 正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库构建及EST初步分析被引量：2
- 2011年
- 【目的】构建猪淋巴细胞基因文库,初步绘制正常猪外周血淋巴细胞的基因表达谱,为进一步筛选免疫相关基因提供平台。【方法】以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,进一步扩增后,获得猪外周血淋巴细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合,并进行序列分析和注释。【结果】构建了正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库,获得库容量为1.2×106PFU/mL、重组率为93.3%、85%插入片段处于750～2000bp的高质量文库;随机测定1100条ESTs,经拼接和聚类,获得152条高表达的基因重叠群(Contigs)和619条低表达基因——单拷贝的EST(Singletons);经序列比对分析,发现23.3%ESTs为与任何物种都没有匹配的新基因,75.9%ESTs为与猪没有匹配的新基因。用GO数据库对获得的EST进行基因功能分类和KEGG路径图分析,发现丝裂原活化蛋白激酶途径(Mi-togen-activatedproteinkinase,MAPK)、钙信号通路、胰岛素信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Toll-like受体信号通路、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路的基因均有较高表达。【结论】大部分的猪外周血淋巴细胞基因尚未被分离和鉴定出来,但这些基因mRNA转录和表达丰度均较高,且在猪外周血淋巴细胞中起着非常重要的作用。
- 李晓宁孙石开蔡新斌杨坚苏丽娟章民李晓泉尹珊李延生罗廷荣
- 关键词：外周血淋巴细胞CDNA文库
