国家自然科学基金(31060333)
- 作品数：10 被引量：49H指数：5
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- 结核分枝杆菌临床分离株链霉素耐药性的检测及耐药基因突变位点分析被引量：6
- 2017年
- 为检测结核分枝杆菌链霉素(streptomycin,SM)耐药性,分析耐药基因突变,探讨DNA测序分析技术在结核分枝杆菌链霉素耐药性检测中的应用价值。采用方法:1、用传统的比例法药敏试验对49株结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药性检测。2、用DNA测序分析技术对49株结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药相关基因Rpsl和rrs的突变位点分析,筛查耐药相关突变位点。3、探讨DNA测序分析技术对结核分枝杆菌临床分离株进行链霉素耐药性检测的效率。结果:1、传统比例法药敏试验结果显示,49株实验菌株中16株为链霉素耐药株,33株为链霉素敏感株。2、Rpsl基因DNA测序。结果显示:Rpsl基因只存在一个突变位点,为第43位密码子AAG的突变,突变形式为AAG→AGG,氨基酸由赖氨酸(Lys)变为精氨酸(Arg)。rrs基因DNA测序结果发现:rrs基因共存在5个突变位点,分别为第513位碱基A突变为G、第523位碱基A缺失、第598位碱基A突变为G、第599位碱基A缺失、第612位碱基A缺失,其中第513位碱基突变只存在于链霉素耐药株中,其余4个突变位点在耐药株和敏感株中均存在。即初步认为Rpsl基因第43位密码子的突变及rrs基因第513位碱基的突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性有关。3、分析Rpsl基因和rrs基因突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性之间的关系,结果显示:16株链霉素耐药株中13株存在Rpsl基因第43位密码子的突变,1株存在rrs基因第513位碱基的突变。以传统的比例法药敏结果为参照,以DNA测序分析Rpsl基因或rrs基因发现Ppsl基因发生第43位密码子或rrs基因第513位碱基突变为判断菌株耐药的标准,DNA测序分析技术对结核分枝杆菌链霉素耐药性检测的敏感性为87.5%,特异性为96.97%。由此可知,初步认为Rpsl基因第43位密码子的突变及rrs基因第513位碱基的突变与结核分枝杆菌链霉素耐药性有关。用DNA测序分析结核分�
- 杨彩虹曹旭东史静雪姬祥于璐袁俐吴长新陈创夫
- 关键词：结核分枝杆菌链霉素DNA测序耐药性
- 结核分枝杆菌CFP10基因真核表达质粒的构建及表达被引量：1
- 2013年
- 为研究结核杆菌毒力因子CFP10在结核杆菌感染细胞过程中的功能,本研究根据GenBank中登录的结核杆菌H37Rv的CFP10基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到CFP10基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM18-T载体中,测序验证后,再将CFP10基因亚克隆至pEGFP-N1中,经核苷酸序列测定和酶切鉴定获得重组表达质粒pEGFP-N1-CFP10,分别转染293T细胞和U937细胞。经western blot分析表明CFP10-EGFP融合蛋白在293T细胞和U937细胞中均获得了表达。通过激光共聚焦显微镜观察显示在293T细胞和U937细胞,CFP10-EGFP融合蛋白主要分布于细胞质。本研究为进一步研究毒力因子CFP10在感染宿主细胞中的作用奠定了基础。
- 李跃峰张俊波监通贺志锐王讲德张辉陈创夫曹旭东
- 关键词：结核病CFP10ESAT6
- 北疆地区结核分枝杆菌基因分型及耐药性分析被引量：6
- 2016年
- 目的对北疆地区结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型和耐药性检测，研究不同基因型在该地区的流行及耐药性。方法收集北疆地区114株结核分枝杆菌临床分离株，采用间隔区寡核苷酸和多位点可变串联重复序列（VNTR）技术进行基因分型，应用NTsys2．10e软件对结果进行聚类分析，比例法检测临床分离株的耐药性。结果114株临床分离株，间隔区寡核苷酸分型结果和RD105缺失检测法结果共同显示北京基因型占62．28％（71／114）、非北京基因型占37．72％（43／114）。分2大簇（A和B）：A簇有34株，北京基因型占11．77％（4／34），非北京基因型占88．23％（30／34）；B簇有80株，北京基因型占83．75％（67／80），非北京基因型占16．25％（13／80）。耐药显示：总耐药率为40．35％（46／114），耐多药（MDR）率为19．30％（22／114）；北京基因型耐药率为42．25％（30／71），非北京基因型的耐药率为37．21％（16／43），差异无统计学意义（χ^2=0．28，P=0．60）。其中，北京基因型MDR耐药菌株占22．54％（16／71）结论北疆地区北京基因型和非北京基因型的耐药率没有差异，但MDR菌株流行主要是由北京基因型引起的。
- 包海洋曹旭东秦莲花杨华吴长新刘忠华陈创夫
- 关键词：基因型
- 环介导等温扩增法检测牛奶中结核分枝杆菌条件的优化被引量：5
- 2016年
- 为优化环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）法检测牛奶中结核分枝杆菌的条件,以结核分枝杆菌高度保守的16SrRNA基因为靶基因设计3对特异性引物（F3-B3、FIP-BIP、FLP-BLP）进行试验。比较改良后的CATB/NaCl法、细菌基因组DNA提取试剂盒及热裂解法提取其DNA的效率,确定最佳的提取方法。用灭菌处理过的牛奶对结核分枝杆菌悬液进行倍比稀释以确定该检测方法的敏感度。以牛奶中常见的布鲁氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、巴氏杆菌、沙门氏菌为对照,对该方法进行特异性测试。结果表明,改良后的CTAB/NaCl法对牛奶中结核分枝杆菌DNA的提取效果要优于其他两种方法。LAMP法检测结核分枝杆菌的灵敏度为3×10^0CFU/mL,对人工阳性乳中结核分枝杆菌检测的灵敏度为3×10^1 CFU/mL。
- 杨敏王慧党于潞吴长新张辉曹旭东陈创夫
- 关键词：环介导等温扩增结核分枝杆菌牛奶
- 结核杆菌CFP10和ESAT6真核表达载体双转染真核细胞的观察
- 2015年
- 为了构建结核分枝杆菌两个毒力因子CFP-10基因和ESAT-6基因共同表达的真核细胞模型,本实验采用脂质体转染方法,将重组表达载体CFP-10-PDs Red1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1同时转染真核细胞293FT,通过倒置荧光显微镜和激光共聚焦观察,并经western blot检测分析。结果显示,经双转染的293FT细胞能够分别发出红色和绿色荧光,既能表达CFP-10,又能表达ESAT-6,且表达的蛋白分布于细胞质中,表明模型构建成功。由此可知,构建的这个细胞模型为进一步研究这两种毒力因子在宿主细胞中的作用机制奠定了基础。
- 王爽付强史慧君于潞李志强杜新辉曹旭东
- 关键词：结核杆菌真核细胞CFP-10ESAT-6
- 高分辨率熔解曲线技术用于结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药性的快速检测被引量：13
- 2017年
- 目的评价高分辨率熔解曲线分析技术(high-resolution melting curve,HRM)检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的应用价值。方法 1)通过传统比例法药敏实验对本实验室保存的49株结核分枝杆菌进行异烟肼耐药性分析。2)进一步对该结核分枝杆菌进行异烟肼耐药相关基因KatG基因和inhA基因进行异烟肼耐药决定区测序分析,筛查突变位点。3)根据筛查到的突变位点设计高分辨率熔解曲线分析所用的特异性引物,对异烟肼耐药基因耐药决定区进行高分辨率熔解曲线分析检测DNA突变,评估用高分辨率熔解曲线分析技术对结核分枝杆菌异烟肼耐药性检测的效率。结果 1)比例法药敏结果显示,49株实验菌株中20株为异烟肼耐药株,29株为异烟肼敏感株。2)测序分析结果显示:(1)KatG基因出现了4种突变形式,分别是234单位点突变;234、315双位点突变;234、463双位点突变;234、315、463三位点联合突变。(2)inhA基因检测到3种突变,即-8位、-15位、-152位。3)(1)对耐药株的基因突变进行分析发现:20株异烟肼耐药株中11株存在KatG基因第315位密码子的突变、占异烟肼耐药株的55%;6株存在inhA基因-15(4株)位碱基、-8(1株)位碱基、-152(1株)位碱基的突变,共占异烟肼耐药株的30%;2株同时存在基因KatG315密码子和inhA-15位碱基的突变,占异烟肼耐药株的10%;1株均未检测到KatG基因和inhA基因的突变,占异烟肼耐药株的5%。通过基因突变检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的敏感性为95%、特异性为100%。(2)用高分辨率溶解曲线检测实验菌株耐药基因突变的结果显示,18株存在基因突变,24株不存在基因突变,检测的灵敏度为94.7%、特异性为80%。(3)以高分辨率熔解曲线检测到突变为耐药的判断标准,检出19株为耐药株,24株为敏感株。以比例法药敏结果为参照,检测的灵敏度为95%、特异性为82.76%。结论高分辨率溶解曲线用于结核分枝杆菌
- 杨彩虹杨敏于璐包海洋吴长新曹旭东陈创夫
- 关键词：结核分枝杆菌DNA测序耐药性异烟肼
- 高分辨率熔解曲线检测结核分枝杆菌对利福平耐药性研究被引量：4
- 2019年
- 目的评价高分辨率熔解曲线(high resolution melt,HRM)技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的临床应用价值。方法用传统结核分枝杆菌药敏试验对新疆石河子大学人畜共患病实验室保存的50株临床分离菌进行耐药性检测。以rpoB基因的利福平耐药决定区为靶标设计引物进行高分辨率熔解曲线分析,判断分离出的结核分枝杆菌是否对利福平耐药。应用SPSS 17.0分析,以传统结核分枝杆菌药敏试验结果为标准,计算两种方法的符合率。用χ~2检测分析比例法药敏结果与高分辨率熔解曲线检测结果的差异性。用Kappa检测分析两种结果的一致性。结果药敏试验结果显示,50株菌中有1株为非结核分枝杆菌;49株中有20株同时对利福平和异烟肼耐药、1株仅对利福平耐药;HRM检测结果显示,21株对利福平耐药,28株为敏感株。以传统药敏试验为参考,HRM检测利福平耐药性的敏感性为86.36%,特异性为92.59%,经Kappa检验显示,两种方法检测结果具有高度一致性。结论 HRM可快速检测结核分枝杆菌对利福平的耐药性,具有较高灵敏度,在耐药结核病的早期诊断上有一定的应用价值。
- 杨敏于潞吴长新张辉陈创夫曹旭东
- 关键词：结核分枝杆菌利福平耐药性RPOB基因
- PMA-qPCR快速检测结核活菌方法的建立被引量：4
- 2014年
- 为建立快速鉴别诊断结核活/死菌的方法,本研究应用PMA染料与实时定量PCR技术结合(PMA-qPCR),以结核标准株16 sRNA基因为靶基因,PMA对样品基因组提取物进行处理,PMA能够与死细胞DNA分子共价交联并抑制DNA分子扩增。结果显示:PMA浓度在3μg/mL,曝光时间大于15 min时,PMA既不影响活菌的的扩增,又能有效抑制死菌的扩增;当PMA浓度大于20μg/mL时,PMA影响活菌DNA的扩增;PMA-qPCR技术能够定量不同比例的结核活/死菌悬液中的活菌。结论:PMA-qPCR技术能够快速准确检测出结核杆菌中的活细胞。
- 温书香王慧勤曹旭东赵新霞李亚张亚丽陈鹏博纪太旺陈创夫袁莉
- 金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌在不同环境下存活率的比较被引量：9
- 2016年
- 目的用几种不同方法处理细菌,观察对比革兰阳性菌与革兰阴性菌存活率的差异,了解革兰阳性菌和革兰阴性菌的生理特征。方法选取金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌为代表,等比稀释后观察两组细菌A600值的变化情况及与CFU的关系;经过反复冻融、酸碱处理,计数两组细菌CFU,观察两组细菌存活率差异;使用相同浓度的溶壁酶对两组细菌细胞壁进行裂解,观察两组细菌菌体蛋白释放情况。结果等比稀释两组细菌,A600值及CFU计数并未按等比下降。在无保护剂的条件下反复冻融3次,大肠埃希菌全部死亡,金黄色葡萄球菌尚有16.14%存活。反复冻融7次后金黄色葡萄球菌全部死亡。在有保护剂的条件下反复冻融5次,大肠埃希菌全部死亡,金黄色葡萄球菌尚有22.09%存活。反复冻融13次后金黄色葡萄球菌全部死亡。在不同pH值培养条件下,金黄色葡萄球菌耐受酸碱变化的范围宽,而大肠埃希菌表现出耐酸的特点。经相同浓度溶壁酶作用后,大肠埃希菌菌体蛋白释放量多于金黄色葡萄球菌。结论金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌对反复冻融、酸碱及溶壁酶的耐受性不同,可供做细菌学实验时参考。
- 于潞杨敏李默杜新辉孟祥慧曹旭东
- 关键词：革兰阳性菌革兰阴性菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌存活率
- 结核分枝杆菌ESAT6基因真核表达载体的构建及表达被引量：4
- 2013年
- 为了研究结核杆菌毒力因子ESAT6在结核杆菌感染细胞过程中的功能。采用分子生物学方法,根据Gen-Bank中登录的结核杆菌H37Rv的ESAT6基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到ESAT6基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM18-T载体中,测序验证后,再将ESAT6基因亚克隆至pEGFP-N1中,经核苷酸序列测定和酶切鉴定获得重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6。用重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6转染293T细胞。结果显示:重组表达质粒pEGFP-N1-ESAT6测序结果正确,转染细胞后出现绿色荧光,经Western blot分析鉴定,可见约35kDa的预期蛋白条带,证实ESAT6-EGFP融合蛋白在293T细胞中获得了表达。研究结果为进一步研究毒力因子ESAT6在感染宿主细胞中所发挥胞内生存机制奠定了基础。
- 李跃峰付强张俊波史慧君李志强程婷婷张辉曹旭东陈创夫
- 关键词：结核病ESAT6CFP10
