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人tau融合蛋白的原核表达及纯化: 2007年; 目的构建人His-tau和GST-tau融合蛋白表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达及纯化。方法以质粒pEGFP-tau为模板通过PCR扩增出人tau全长cDNA,并构建到原核表达载体pET28a和pGEX-5X-1中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21中,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE染色及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。分别使用His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B与融合蛋白结合来纯化融合蛋白。结果成功构建原核表达质粒pET28a-tau和pGEX-5X-1-tau并在大肠杆菌BL21中诱导其大量表达。经His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B纯化后,可以得到较纯化的His-tau和GST-tau融合蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗tau单克隆抗体(tau-5)所识别的融合蛋白分子量与理论值相近。结论构建了人tau两种原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该蛋白,为进一步的tau与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。; 梁燕王海萍冯利杰李琪沈玉先; 关键词：质粒

tau蛋白的过度表达对非神经源细胞生长与分化的影响被引量：10: 2008年; 目的观察外源性tau蛋白的过度表达对非神经来源的293T细胞生长与分化的影响。方法构建带有GFP标签的表达人全长tau蛋白的质粒pEGFP-C1-tau,并转染293T细胞,通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察及免疫印迹等方法,观察tau的过度表达对293T细胞的生长与分化的影响。结果在瞬时转染的293T细胞中可以观察到,GFP全细胞分布,而GFP-tau主要定位于胞质。tau的过量表达可引起细胞形态改变,如突起减少或消失,细胞分裂受阻及多核巨细胞的形成等,最后导致细胞死亡。在稳定转染细胞中,tau蛋白的过度表达可诱导细胞出现凋亡的特征性改变。结论tau蛋白在非神经源性细胞中的过度表达可影响细胞的分裂、分化,并诱导细胞凋亡,提示tau蛋白有直接的细胞毒作用。; 李琪冯利杰王海萍梁燕沈玉先; 关键词：TAU蛋白转染细胞形态

内质网应激与神经元退行性变被引量：10: 2007年; 内质网(endoplasmic reticulum,ER)是蛋白质修饰、折叠和钙贮存的场所。ER内未折叠或错折叠蛋白积聚和钙平衡失调均可导致ER应激。早期的ER应激或未折叠蛋白反应,是一种自身代偿过程,对细胞起到保护作用,而长期、严重的ER应激则会诱导细胞凋亡及死亡。研究发现,ER应激在许多神经退行性疾病的病理机制中起重要作用。然而,确切的机制目前仍不清楚。该文就ER应激在神经元退行性变中的作用作一综述。; 冯利杰王海萍沈玉先; 关键词：内质网应激神经退行性疾病未折叠蛋白反应细胞凋亡

非神经源性细胞中tau蛋白的稳定表达及磷酸化被引量：5: 2007年; 目的建立稳定表达tau蛋白的稳转细胞系，并观察tau蛋白的过度磷酸化对稳转的非神经源性细胞形态和活性的影响。方法构建pEGFP-C1-tau真核细胞表达质粒，建立稳转和表达融合蛋白GFP-tau的293T细胞系，并用不同浓度的蛋白磷酸酯酶抑制剂冈田酸（OA）处理细胞以诱导其过度磷酸化，通过荧光显微镜观察细胞形态的变化，用MTT法监测细胞的活性及免疫印迹法检测tau蛋白的表达及磷酸化水平。结果成功地建立了稳定表达GFP-tau蛋白的非神经源性稳转细胞系，该细胞系在稳转后3—4周，细胞生长状态良好，细胞形态和突起生长基本正常。用OA处理后，细胞突起消失、变圆，贴壁性能差，死亡的细胞数量也增多，这些变化随着OA作用时间的延长或浓度的增加更加明显；MTT法显示细胞的增殖活性明显下降；免疫印迹法提示，100nmol／L OA作用8h后，磷酸化tau水平增加。结论对于稳定表达tau蛋白的非神经源性细胞，OA可降低其增殖活性，该作用可能与OA抑制细胞内去磷酸化过程有关。; 冯利杰李琪方辉王海萍粱燕沈玉先; 关键词：过度磷酸化

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教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-04-0589)