浙江省自然科学基金(Y2100971)
- 作品数：4 被引量：1H指数：1
- 相关作者：梁韶晖兰兰李春香郝振华华倩倩更多>>
- 相关机构：温州医科大学宁波卫生职业技术学院温州医学院更多>>
- 发文基金：浙江省自然科学基金浙江省大学生科技创新活动计划(新苗人才计划)项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 弓形虫微线体蛋白MIC2和M2AP真核表达载体的构建
- 2014年
- 目的构建弓形虫RH株微线体蛋白M2AP和MIC2的真核表达载pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,为建立同时表达MIC2和M2AP蛋白的重组毕赤酵母表达系统,制备重组粘附蛋白复合体MIC2-M2AP奠定基础。方法提取弓形虫RH株速殖子总RNA,用Oligo dT-Adaptor引物逆转录合成cDNA。根据已知的弓形虫mic2和m2ap基因序列,采用引物设计软件Primer premier5.0自行设计并合成引物,以cDNA为模板,PCR扩增mic2和m2ap基因,克隆入pMD-19-simple-T载体,经酶切和测序鉴定后回收目的片段,分别插入至pGAPZαA内,构建重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,转化入E.coli DH5α。提取转化菌质粒,进行酶切和测序鉴定。结果 PCR扩增得到的mic2和m2ap基因分别为2 200bp和1 000bp,与预期大小一致。T-A克隆重组质粒pMD19-T-mic2、pMD19-T-m2ap和重组酵母表达质粒pGAPZαA-mic2、pGAPZαA-m2ap经测序鉴定,与GenBank收录的弓形虫mic2基因和m2ap基因序列同源性为100%,重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap构建成功。结论成功构建弓形虫重组毕赤酵母表达载体pGAPZαA-mic2和pGAPZαA-m2ap,为进一步研究MIC2和M2AP相互作用机制及其免疫保护效应奠定了基础。
- 谢彬彬章庆伟陈亲芬白炳君林季刘文权梁韶晖
- 关键词：刚地弓形虫真核表达
- 人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞体外培养弓形虫速殖子
- 2014年
- 目的 比较弓形虫RH株速殖子在人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞内的增殖情况. 方法 按照弓形虫速殖子∶细胞为1∶1的比例将弓形虫RH株速殖子分别与人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞共培养0、6、12、24、48 h后,于显微镜下观察细胞内虫体增殖情况.在两种细胞培养瓶中分别接种弓形虫RH速殖子,连续传代,每隔10代取弓形虫速殖子,将其密度调整为1×10^7个/ml,0.3 ml/只,腹腔接种ICR健康小鼠,记录小鼠存活时间. 结果 在相同条件下弓形虫速殖子侵入人巨噬细胞的时间早于侵入人包皮成纤维细胞的时间;共培养48 h时,绝大部分弓形虫速殖子胀破细胞,游离在细胞外.在两种细胞培养瓶中分别接种3×106弓形虫RH速殖子,约72 h后均可获得大量游离的弓形虫速殖子,2～3d传1代.人巨噬细胞内连续传代约30次,每代可获得（1×10^7～4×10^7）个速殖子,约增殖3～13倍;人包皮成纤维细胞中连续传代30次,每代可获得（1×10^7～3×10^7）个速殖子,约增殖3～10倍.弓形虫速殖子传代次数为10、20和30代时,人巨噬细胞内传代的弓形虫速殖子接种小鼠的存活时间分别为（4.3±0.5）、（4.0±0.8）、（4.3±1.2）d,人包皮成纤维细胞内传代的弓形虫速殖子接种小鼠的存活时间分别为（4.0±0.0）、（3.7±0.9）、（4.3±0.5）d,各代之间差异无统计学意义（P＞0.05）,弓形虫速殖子毒力未见明显改变. 结论 弓形虫RH株速殖子可在人巨噬细胞和人包皮成纤维细胞内增殖并长期稳定传代.
- 兰兰吴翡斐梁韶晖
- 关键词：弓形虫速殖子人巨噬细胞体外培养
- 基因芯片分析弓形虫感染宿主细胞microRNAs差异表达被引量：1
- 2013年
- 目的:研究弓形虫感染人包皮成纤维细胞(HFFs)的microRNAs(miRNAs)差异表达。方法:基因芯片分析弓形虫感染的HFFs的miRNAs差异表达,并用实时荧光定量RT-PCR法和Northern blot法验证miRNAs差异表达。结果:弓形虫感染HFFs的46种miRNAs表达量有1倍以上上调,37种miRNAs表达量有1倍以上下调。其中4种差异表达的miRNAs的实时荧光定量RT-PCR法和Northern blot法验证结果与基因芯片分析结果一致。结论:弓形虫感染可导致宿主细胞的miRNAs差异表达,差异表达的miRNAs可能在弓形虫和宿主细胞的相互作用中起调控作用。
- 李春香郝振华兰兰华倩倩梁韶晖
- 关键词：弓形虫微小RNA基因芯片
- 弓形虫三磷酸核苷水解酶基因真核表达载体的构建
- 2011年
- 目的:构建编码弓形虫RH株三磷酸核苷水解酶(NTPase-Ⅱ)重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ。方法:采用PCR从弓形虫基因组DNA中扩增NTPase-Ⅱ基因,克隆入pGEM-T Easy载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定;采用亚克隆将NTPase-Ⅱ基因克隆至真核表达载体PVAX1,筛选阳性重组质粒PVAX1-NTPase-Ⅱ,进行PCR、酶切和测序鉴定。结果:NTPase-Ⅱ的重组真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,大小为1 887 bp,与预期大小一致;重组真核表达载体的核苷酸序列,与GenBank中的相应序列100%同源。结论:成功构建重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。
- 郑晓云李丽宁谭峰梁韶晖
- 关键词：刚地弓形虫真核表达
