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沙眼衣原体D型株的增殖培养及鉴定被引量：1: 2007年; 目的探讨沙眼衣原体细胞增殖培养和鉴定的方法。方法将沙眼衣原体接种于Hep-2细胞中,收获培养物,将其分别用Giemsa染色、免疫层析法、PCR技术和核苷酸序列检测方法进行鉴定。结果经免疫层析法鉴定所收获的培养物为沙眼衣原体,并经Giemsa染色,可见其典型包涵体结构,PCR技术和核苷酸序列检测方法进一步鉴定其血清型别为D型。结论Hep-2细胞可用于沙眼衣原体的增殖培养。; 王乐丹李强薛向阳张丽芳; 关键词：沙眼衣原体 HEP-2细胞

HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合DNA诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫的研究: 2010年; 目的探讨人乳头瘤病毒（HPV）6b结构蛋白L1和沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）多表位嵌合DNA（HPV6b L1/Ct MOMP）诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫效应,及HPV6b L1对Ct MOMP多表位基因诱导细胞免疫的增强作用.方法将Ct MOMP多表位基因连接在经真核密码子优化的HPV6b L1羧基端,构建嵌合重组质粒pcDNA3.1（＋）/HPV6b L1/Ct MOMP多表位,经酶切和测序证实后,转染COS-7细胞,间接免疫荧光鉴定其在真核细胞中的表达;将纯化后的嵌合重组质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,并设置pcDNA3.1（＋）/Ct MOMP多表位质粒、pcD-NA3.1（＋）和PBS三组对照.采用0、2、4周免疫程序,DNA剂量为每只150μg/次.于末次免疫后2周,分别用乳酸脱氢酶（LDH）释放法和细胞内细胞因子染色-流式细胞术（ICS-FAGS）检测小鼠脾细胞对Ct MOMP多表位蛋白和HPV6b L1蛋白的特异性CTL活性,胞内细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-10产生水平等细胞免疫应答指标.结果免疫后,在效靶比（E∶T）分别为40∶1、20∶1时,pcDNA3.1（＋）/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合重组质粒免疫组小鼠产生了针对Ct MOMP多表位蛋白特异性CTL杀伤活性（44.56%±4.02%,35.35%±2.89%）和HPV6b L1蛋白特异性CTL杀伤活性（27.08%±2.04%,21.68%±4.06%）,与各对照组比较差异有统计学意义（F=72.87,F=114.55,P＜0.05;F=30.04,F=10.47,P＜0.05）,且显著高于pcDNA3.1（＋）/Ct MOMP多表位质粒组（35.50%±2.68%,30.24%±1.75%;12.27%±3.36%,9.32%±3.07%;P＜0.05）;而pcDNA3.1（＋）/Ct MOMP多表位质粒组小鼠仅显示了Ct MOMP多表位特异性的CTL杀伤活性,与对照组比较差异也有统计学意义（F=58.85,F=120.21;P＜0.05）.胞内细胞因子IFN-γ的产生水平,pcDNA3.1（＋）/HPV6b L1/Ct MOMP多表位嵌合质粒组（4.34%±0.06%）高于pcDNA3.1（＋）/Ct MOMP多表位质粒组（3.14%±0.18%）,与对照组比较差异有统计学意义（F=473.83,P＜0.05）,而重组质粒组较空载体组和PBS对; 石朝辉朱珊丽许文陆丽君李玲玲张丽芳; 关键词：主要外膜蛋白细胞毒T细胞

沙眼衣原体主要外膜蛋白T、B细胞多表位基因的表达及其鉴定被引量：4: 2007年; 目的对沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位进行预测和选择，并进行Ct MOMP多表位基因克隆和多表位蛋白的原核表达及其抗原性分析，为研制多表位Ct疫苗提供基础资料。方法利用SYFPEITHI法和多项式方案结合预测HLA-A2限制性的0MOMP的CTL表位，选取含多个CTL表位的基因片段作为目的基因，兼顾目的基因上下游存在的TH和B细胞表位的基因，共同组成含CTL、TH和B细胞表位的多表位基因。多表位基因经密码子优化后进行全序列合成，克隆入原核表达载体pET-32a（＋），经IPTG诱导在大肠杆菌BL21（DE3）表达并纯化，经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。结果经预测筛选得到了多个MOMPHLA-A2限制性的CTL表位，成功克隆了含CTL、TH、B表位的MOMP多表位基因，并在大肠杆菌中获得了高效表达。表达产物的相对分子质量（Mr）约24×10^3，与预期肘，相符，并用Western blot方法初步证实多表位蛋白有抗原特异性。结论成功设计了Ct MOMP的T、B细胞多表位基因，并证实在原核表达系统中获得正确表达的多表位蛋白具有良好的抗原性。; 朱珊丽郑丹欧琴陈俊陈韶张丽芳; 关键词：沙眼衣原体主要外膜蛋白表位

沙眼衣原体热休克蛋白60的B细胞表位预测及分析被引量：2: 2010年; 目的:分析沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)热休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)的二级结构并预测其B细胞优势表位,进一步分析其在沙眼衣原体相关自身免疫性疾病发病中的意义。方法:以CT标准株(E/UW-5/Cx)HSP60的完整氨基酸序列为基础,分别采用SOPMA、GOR、nnPredict和HNN四种方法预测CHSP60的二级结构,并结合其跨膜区域、亲水性、表面可及性、抗原性、极性和柔韧性等参数进行综合分析,预测CHSP60可能的B细胞优势表位,并将B细胞优势表位与人HSP60的氨基酸序列进行比对,分析两者之间的同源性,寻找可能与自身免疫性疾病相关的B细胞表位。结果:四种方法对CHSP60二级结构的预测表明,其二级结构中柔性区域以无规卷曲为主,少见转角。其B细胞优势表位可能位于氨基酸79～85、135～140、433～440和526～532区域,而上述序列与人HSP60氨基酸序列比对后,发现其135～140、433～440和526～532区域与人HSP60氨基酸159～164,457～464、549～556区域有较高的同源性。结论:CHSP60可能的B细胞优势表位中,135～140、433～440和526～532区域可能与CT感染相关自身免疫性疾病的发病有关。; 王作鹏林文军金晓兰陆丽君朱珊丽张丽芳; 关键词：沙眼衣原体热休克蛋白60 B细胞表位

沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位基因的免疫原性研究: 2009年; 目的构建包含沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）主要外膜蛋白（major outer membrane protein，MOMP）多表位基因的真核表达质粒pcDNA3．1-CtMOMP168，检测其诱导BALB／c小鼠产生CtMOMP特异性体液和细胞免疫反应的水平。方法构建包含CtMOMP多表位基因的重组质粒pcDNA3．1，CtMOMP168并以肌肉注射方式免疫BALB／c小鼠，同时设置pcDNA3．1组和PBS组对照（每组12只，每只100μg/次）。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）、乳酸脱氢酶释放法及细胞内细胞因子染色-流式细胞术（ICS—FACS）分别检测免疫小鼠血清中CtMOMP特异性抗体的滴度及其抗体亚型、脾脏中细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的杀伤活性及特异性分泌细胞因子，如γ-干扰素-（IFN-1）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）等的CD3^＋T细胞的水平。结果同pcDNA3．1（A490=0．180±0．025）和PBS免疫（A490=0．110±0．015）相比，pcDNA3．1-CtMOMP168免疫可刺激小鼠产生高效价0特异性IgG抗体（A490=0．973±0．136；血清滴度1：1000），且抗体亚型以IgG2a为主，差异有统计学意义（F=106．884，P〈0．05）；pcDNA3．1-CtMOMP168免疫组小鼠脾细胞中CTL杀伤活性（41．71％±8．34％）高于pcDNA3．1组（18．40％±3．45％）和PBS组（14．50％±2．42％），差异有统计学意义（F=22．315，P〈0．05；效靶比为50：1）；pcDNA3．1-CtMOMPl68免疫组小鼠的脾细胞中CtMOMP特异性CD3^＋IFN-γ^＋T细胞的水平（1．15％±0．16％）高于pcDNA3．1组（0．12％±0．08％）和PBS组（0．09％±0．03％），差异有统计学意义（F=99．638，P〈0．05），而pcDNA3．1-CtMOMP168组IL4^＋CD3^＋T细胞（0．13％±0．08％）和IL-10^＋CD3^＋T细胞（0．14％±0．08％）的水平与pcDNA3．1（0．07％±0．05％，0．13％±0．06％）和PBS（0．08％±0．04％，0．07％±0．04％）组比较差异无统计学意义（F值分别为0．886、1．112，P�; 朱珊丽石朝辉李文姝陈俊张丽芳; 关键词：细菌外膜蛋白质类表位

密码子优化的HPV6b L1 DNA诱导BALB／c小鼠产生增强的免疫应答: 2009年; 目的探讨真核细胞偏好密码子优化对人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）6b型L1 DNA诱导BALB／c小鼠特异性体液和细胞免疫应答的增强效应。方法利用PCR从尖锐湿疣组织中扩增HPV6b L1基因，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋），构建野生型pcDNA3．1（＋）／HPV6bLl（wt）并进行鉴定；同时，对HPV6b L1基因进行真核细胞偏好密码子优化，进一步通过重叠PCR的方法获得全长基因，构建密码子优化的重组质粒pcDNA3．1（＋）／HPV6bLl（rood．）并进行鉴定。将6～8周龄雌性BALB／c小鼠分成4组，分别肌肉注射3次pcDNA3．1（＋）／HPV6bLI（mod．）、pcDNA3．1（＋）／HPV6bL1（wt）、pcDNA3．1（＋）载体和PBS，间隔2周，每次剂量为150μg／鼠。分别于免疫前和免疫后每隔2周，收集血清，用间接ELISA检测血清IgG抗体；并于第8周取小鼠脾细胞，采用乳酸脱氢酶释放法，按效应细胞与靶细胞之比（E：T）为5：1、10：1、20：1进行免疫小鼠特异性CTL杀伤活性检测。结果成功构建了密码子优化的HPV6b L1重组质粒。小鼠免疫后血清特异性IgG抗体水平随着免疫时间和次数的增加而升高。pcDNA3．1（＋）／HPV6bLl（mod．）组血清IgG抗体在第8周达到高峰，与pcDNA3．1（＋）／HPV6bLl（wt）、载体和PBS对照组相比差异均有统计学意义（t=18．138、t=29．140、t=30．840，P值均〈0．01）；而pcDNA3．1（＋）／HPV6bLl（wt）组与载体和PBS组比较差异也有统计学意义（t=20．072、t=22，457，P值均〈0．01）。在特异性CTL杀伤实验中，当E：T分别为5：1、10：1、20：1时，pcDNA3．1（＋）／HPV6bLI（mod．）组的脾细胞特异性CTL杀伤率明显高于pcDNA3．1（＋）／HPV6bLl（wt）组（t=11．892、t=15．329、t=2．911，P值均〈0．05）、载体组（t=12．936、t=16．613、t=13．901，P值均〈0．01）和PBS对照组（t=14．768、t=18．935、t：10．925，P; 陆丽君石朝辉孟锐锋朱珊丽肖敏张丽芳; 关键词：密码子抗体生成

E血清型沙眼衣原体主要外膜蛋白B细胞表位的预测被引量：2: 2008年; 基于E血清型沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，CT）主要外膜蛋白（Major outer membrane protein，MOMP）氨基酸序列，采用Hopp-Woods的亲水性方案、Emini表面可及性方案、Jameson-Wolf抗原指数方案和Janin可及性方案等，辅以对MOMP蛋白的二级结构中的柔性区域及跨膜区域的分析，预测CTMOMP蛋白的B细胞表位。推测最有可能的B细胞表位位于MOMP蛋白N端第73～81区段、217～225区段、第377～386区段、第261～270区段和第161～175区段内或它们的附近。用多参数预测CTMOMP蛋白的B细胞表位，为进一步研究蛋白特性及表位疫苗研制奠定了基础。; 朱珊丽石朝辉王鹏飞李文姝张丽芳; 关键词：沙眼衣原体主要外膜蛋白 B细胞表位

HPV6L1/CtMOMP多表位融合基因在COS-7细胞的表达及其在小鼠的免疫效果观察被引量：2: 2010年; 研究人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6b结构蛋白L1(HPV6b L1)基因佐剂增强沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(MOMP)多表位(Ct MOMP168)DNA疫苗的免疫效果的可能性.构建pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP168融合重组质粒,转染COS-7细胞,用RT-PCR、激光共聚焦显微技术及Western印迹技术检测其表达.分别用pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP168、pcDNA3.1(+)/Ct MOMP168及pcDNA3.1(+)质粒肌肉免疫BALB/c小鼠,ELISA检测外周血中IgG及阴道分泌物中sIgA.结果表明,pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/CtMOMP168可在COS-7细胞中表达;Ct MOMP168组和HPV6b L1/Ct MOMP168组均可刺激小鼠产生抗Ct MOMP特异性的抗体,抗体滴度随免疫次数增加而升高,且HPV6b L1/Ct MOMP168组小鼠产生的抗体滴度明显高于Ct MOMP168组(P<0.05).结果提示,分子佐剂HPV6b L1与CtMOMP多表位基因融合能够显著增强Ct MOMP多表位DNA疫苗的体液免疫应答.; 许文石朝辉朱珊丽陆丽君孟锐峰李玲张丽芳; 关键词：人乳头瘤病毒沙眼衣原体主要外膜蛋白 DNA疫苗

沙眼衣原体主要外膜蛋白生物信息学分析被引量：5: 2009年; 目的:分析和预测E血清型沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)的结构和功能。方法:采用计算机辅助生物软件和网络数据库,从SwissProt蛋白质数据库中检索MOMP氨基酸序列,用Expasy服务器分析预测MOMP蛋白理化性质、二级结构,同时用Pcons服务器分析模拟蛋白质空间结构。结果:分析显示,Ct MOMP蛋白为一跨膜16次的酸性蛋白质,其空间结构为β-桶状膜蛋白,推测其功能为孔蛋白。结论:通过对MOMP生物信息学分析获得该蛋白的特性,为进一步研究Ct的感染与发病机制、研制Ct亚单位疫苗以及研究MOMP新的功能域等提供理论依据。; 朱珊丽尤孙武娄崇洁龚红君张丽芳; 关键词：沙眼衣原体主要外膜蛋白生物信息学

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浙江省自然科学基金(Y205659)

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