国家自然科学基金(30270545)
- 作品数：9 被引量：45H指数：4
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- 相关机构：复旦大学上海交通大学医学院附属瑞金医院浙江大学医学院附属儿童医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 转基因内皮细胞的构建及其在复合血管上种植的初步研究
- 2006年
- 目的:为了解决小口径(直径7mm以下)人造血管术后通畅率低下的问题,利用生物-人工复合血管,结合分子生物学手段,将转入血管内皮生长因子(VEGF165)基因的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)种植于复合血管内腔面,为解决此临床难题提供新的思路和手段。材料方法:构建VEGF165真核表达质粒pCI-neo-VEGF165,获得正确的质粒用于转染HUVEC。从中科院购买HUVEC(代号:ECV-304),用脂质体介导法将pCI-neo-VEGF165转入细胞,经G418筛选后,计数阳性克隆,以比较脂质体和质粒在不同比例情况下转染效率的高低。实验组按质粒和脂质体比例的不同分为4组:1μg/3μl;2μg/6μl;2μg/8μl;3μg/12μl。ELISA检测瞬时转染后HUVEC培养上清中VEGF的表达。再将VEGF165基因瞬时转入HUVEC,利用自己设计的旋转培养装置,将细胞均匀地粘附、种植于复合血管内腔面。复合血管是人工材料(聚酯)和生物材料(成纤维细胞长入,胶原形成)有机结合而成,是将包有聚酯网的硅胶棒埋入绵羊背部皮下组织,3个月后取出,抽去硅胶棒而得到的。结果:脂质体转染效率以2μg/8μl组阳性克隆数最多;ELISA测定瞬时转染后HUVEC培养上清中VEGF的表达量为532·5±43·1pg/ml。使用旋转培养装置的细胞均匀地粘附于复合血管,未使用者细胞积聚于血管腔面下部;转入和未转入VEGF165基因的HUVEC在复合血管内腔面覆盖面积百分比分别为69·9%±3·5%、43·7%±2·5%,有明显改善。结论:转入VEGF后可促进HUVEC在复合血管上生长,旋转培养装置有利于细胞的均匀粘附。
- 顾兴华贾剑国汪洋毛红霞宿燕岗左伋孙爱军张红旗徐丹令邹云增王克强葛均波
- 关键词：血管内皮生长因子人脐静脉内皮细胞转染复合血管
- 大黄素自身抑制血管平滑肌细胞迁移和增殖被引量：15
- 2006年
- 目的探讨大黄素对血管平滑肌细胞迁移和增殖的作用以及大黄素在血管平滑肌细胞中是否存在代谢过程。方法采用Transwell迁移系统和MTT法观察大黄素对血管平滑肌细胞迁移和增殖的影响。结果大黄素能显著抑制平滑肌细胞迁移,5μg/mL大黄素抑制率为83·3%;大黄素呈浓度和时间依赖性抑制平滑肌细胞增殖。然而,血管平滑肌细胞作用24h后,上清液中的大黄素浓度并无显著降低;细胞色素p450氧化酶诱导剂或者抑制剂没有改变大黄素的细胞毒性作用或者细胞内活性氧水平。大黄素的主要代谢酶(细胞色素p450氧化酶)基因表达水平没有显著的上调。结论大黄素能够抑制血管平滑肌细胞的迁移和增殖,并且不被平滑肌细胞代谢,可能作为药物涂层支架的药物。
- 王翔飞葛均波孙爱军徐丹令王克强
- 关键词：大黄素细胞
- 大黄素通过p53途径抑制血管平滑肌细胞增殖的实验研究被引量：17
- 2006年
- 目的探讨p53途径在大黄素抑制血管平滑肌细胞增殖作用中的地位。方法通过细胞计数、老化相关β-半乳糖苷酶染色、Annexin V标记等方法观察大黄素抑制血管平滑肌细胞增殖的特点。^3H-胸苷掺入法测定DNA合成、流式细胞仪了解细胞周期变化、Western blot检测p53蛋白表达变化、基因芯片观察mRNA表达水平。结果（1）1．6～3．1μg／ml大黄素延缓细胞生长，6．3～12．5μg／ml大黄素促进细胞老化，25．0μg／ml大黄素则可显著诱导细胞凋亡。（2）大黄素干预24h后，出现非计划性DNA合成现象，这是DNA损伤的敏感性标志。p53基因和蛋白表达水平呈大黄素浓度依赖性上调。除了细胞增殖基因表达下调，其他基因表达均上调，如细胞老化基因、细胞凋亡基因、DNA损伤修复基因。（3）大黄素能够迅速渗透进入细胞，在细胞内的分布具有明显的选择性，绝大多数以颗粒形态分布于细胞胞浆中，细胞核中也有少量分布。结论大黄素通过损伤DNA激活p53途径。随着大黄素浓度升高，p53途径激活程度也随之增强并产生多种细胞增殖抑制效应，即生长停滞、细胞老化和细胞凋亡。
- 王翔飞葛均波孙爱军徐丹令王克强
- 关键词：大黄素DNA损伤蛋白质P53细胞衰老凋亡
- 野生型犬尿氨酸酶表达载体的构建及酶活性检测
- 2017年
- 目的构建野生型犬尿氨酸酶(KYNU)的真核表达载体,并分析其在HEK293细胞中的表达及其酶活性。方法抽提人肝脏细胞的总RNA,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法获得KYNU基因全长cDNA,将野生型KYNU基因克隆到pcDNA载体质粒中,获得野生型pcDNA-KYNU重组表达质粒,经酶切鉴定和测序验证后转染HEK293细胞,用蛋白质印迹法技术检测野生型KYNU在细胞中的表达,用高效液相色谱法(HPLC)检测HEK293细胞表达的野生型KYNU酶蛋白的活性。结果通过测序及酶切鉴定野生型pcDNAKYNU重组表达质粒扩增后的PCR产物电泳结果显示构建成功,蛋白质印迹法结果显示转染有重组野生型cDNA-KYNU质粒的HEK293细胞能表达KYNU蛋白,HPLC结果显示野生型KYNU酶存在活性。结论成功构建野生型pcDNA-KYNU的真核表达载体,野生型重组质粒在HEK293细胞中能够表达KYNU并具有一定的酶活性。
- 沈杰陈闻东姬开达高平进朱鼎良
- 关键词：野生型高血压高效液相色谱法
- 高血压定位区域犬尿氨酸酶基因多态性与高血压病相关被引量：9
- 2005年
- 目的检测中国汉族人群高血压病定位区域2q14-q23内犬尿氨酸酶基因(kynureninase,KYNU)调控区和编码区的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)及与高血压病的相关性。方法采用直接测序法检测KYNU基因启动子区和外显子序列中的SNP。应用变性高效液相色谱分析(DHPLC)技术对位于编码区且改变氨基酸编码的Lys412Glu(A/G)多态在456例高血压病患者和430例正常对照者中进行分型和关联研究。结果共检测得KYNU基因的16个SNP,其中启动子区6个,编码区2个(均改变氨基酸编码)。Lys412Glu多态基因型分布(χ2=6·693,P=0·035)和等位基因频率分布(χ2=4·188,P=0·041)在高血压病组和正常对照组间差异均有统计学意义,Lys412Glu等位基因频率分布在男性高血压病组和正常对照组间差异有统计学意义(χ2=4·424,P=0·035)。结论中国汉族高血压病定位区域内KYNU基因Lys412Glu多态可能与高血压病相关。
- 张怡张奎星何鑫袁文涛王谷亮茅守玉高平进黄薇朱鼎良
- 关键词：高血压基因酶基因多态性犬尿氨酸变性高效液相色谱分析中国汉族人群基因启动子区
- 大黄素荧光特性对荧光分析的影响被引量：3
- 2006年
- 目的观察大黄素的荧光光谱特性，以探讨其在平滑肌细胞中干预后对荧光分析的影响。方法在体外培养平滑肌细胞中．加入大黄素干预后，对细胞周期、活性氧簇测定以及Annexin V标记等进行荧光分析方法的观察。采用激光共聚焦观察大黄素在细胞内的分布。结果大黄素的最大激发波长为400-465nm，最大发射波长为515-525nm。大黄素对绿色荧光有明显影响，而对红色荧光方法影响轻微。激光共聚焦显示大黄素在细胞内有选择性分布。结论大黄素的绿色荧光特性既可能干扰绿色荧光分析，但也能具有新的用途。
- 王翔飞葛均波王克强钱菊英
- 关键词：大黄素荧光分析细胞激光共聚焦
- 人淋巴细胞犬尿氨酸酶活性的测定被引量：1
- 2006年
- 目的 建立人淋巴细胞犬尿氨酸酶活性的高效液相色谱检测法。方法 以人淋巴细胞总蛋白作为酶的来源，以3-羟基犬尿氨酸为底物，5’磷酸吡哆醛为辅酶，进行酶促反应，产物经ODS色谱柱分离后用荧光检测器定量检测，从单位时间内产物的增加量来计算犬尿氨酸酶的催化活性。结果 该方法检测产物的线性范围是2～400nmol／L。方法的重复性好，日内变异系数（CV）≤3．0％，日间CV≤3．2％。结论 该方法适用于测定各种生物组织样本中犬尿氨酸酶的活性。
- 沈杰高平进顾天华朱鼎良
- 关键词：淋巴细胞活性高效液相色谱法
- 支架内再狭窄与药物支架的临床研究现状被引量：5
- 2006年
- 与经皮冠状动脉成形术（PTCA）相比，金属裸支架显著减少了再狭窄的发生率，但仍高达30％左右。冠脉内放射治疗能够有效治疗支架内再狭窄，但存在许多问题，如晚期血栓形成、边缘效应、动脉瘤样改变、操作人员防护以及再次一再狭窄等。药物支架的出现为支架内再狭窄的预防和治疗提供了新的手段。我们将支架内再狭窄病变分为金属裸支架再狭窄病变、支架再狭窄经冠脉内放射治疗后再次再狭窄病变以及药物支架再狭窄病变3种类型，分别进行阐述。
- 王翔飞葛均波
- 关键词：药物支架经皮冠状动脉成形术支架再狭窄内放射治疗放射治疗后
- Arg188Gln(G/A)突变对犬尿氨酸酶活性的影响
- 2017年
- 目的:验证犬尿氨酸酶(KYNU)Arg188Gln(G/A)突变能否改变KYNU的活性。方法:抽提人肝脏细胞的总RNA,通过RT-PCR法获得KYNU基因全长cDNA,以KYNU基因Arg188Gln位点附近序列为模板设计定点突变引物,完成Arg188Gln(G/A)的定点突变,将突变型和野生型KYNU基因克隆到pcDNA载体质粒中,获得野生型和突变型pcDNA-KYNU重组表达质粒,经酶切鉴定和测序验证后转染HEK293细胞,蛋白质印迹法检测KYNU在细胞中的表达,用高效液相色谱法检测HEK293细胞的KYNU活性。结果:野生型和突变型pcDNA-KYNU重组质粒在HEK293细胞中均能表达有活性的KYNU,KYNU的米氏常数分别为(9.833±0.513)μmol/L和(29.900±0.265)μmol/L,最大酶促反应速率分别为(0·700±0.096)nmol·mg^(-1)·min^(-1)和(0.084±0.003)nmol·mg^(-1)·min^(-1),差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:Arg188Gln(G/A)突变可以减弱KYNU的活性。
- 沈杰陈闻东姬开达高平进朱鼎良
- 关键词：突变载体蛋白质类
