国家质检总局科技计划项目(2011K158)
- 作品数：2 被引量：13H指数：2
- 相关作者：胡方平王婷沈建国王念武更多>>
- 相关机构：福建出入境检验检疫局福建农林大学更多>>
- 发文基金：国家质检总局科技计划项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 基于锁式探针的番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测被引量：10
- 2014年
- 【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,CMM),一直以来都受检测周期的限制,快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增方式,并结合实时荧光PCR技术,旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法,为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列,设计锁式探针的T1和T2臂,使之与CMM的特异性片段碱基序列互补,再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时,先将锁式探针与CMM以及参照菌株的DNA模板在DNA连接酶作用下分别进行环化连接,再用核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ消化未环化的线性锁式探针,最后以环化的锁式探针为模板,在扩增引物的作用下进行实时荧光PCR试验。建立CMM基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法,分别比较该方法的特异性和灵敏度与常规PCR方法的差异,并用该方法对收集的来自日本、韩国和中国台湾的番茄种子以及国内采集的共45份样品进行检测。【结果】基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出CMM,在供试的10种菌株中,只有靶标细菌能被特异性地检测到阳性,空白对照和其他参试菌株均没有荧光信号的增加,检测为阴性。比较该检测方法与常规PCR方法,其特异性和常规PCR方法一致。该检测方法检测灵敏度高,DNA最低浓度检测为50 fg·μL-1,而常规PCR方法检测DNA最低浓度为5 pg·μL-1,灵敏度高于常规PCR两个数量级。对收集的样品进行检测,结果显示,45份样品中共有5份样品CMM检测结果为阳性,分别是日本的番茄种子样品2份(编号Jap1214、Jap1102),永泰采集的样品2份(编号为Yongt1001、Yongt1002)和闽清采集的样品
- 王念武王婷沈建国胡方平
- 关键词：锁式探针番茄种子
- 超分支滚环扩增技术快速检测番茄溃疡病菌被引量：4
- 2013年
- 根据番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,cmm)的一段特异致病基因pat-1序列,按照锁式探针的设计原理设计探针和扩增引物,优化系列反应条件,建立了特异性的cmm超分支滚环扩增技术。实验结果表明该检测技术能够从供试的10种菌中特异性地检出番茄溃疡病菌,检测灵敏度高,DNA最低检测浓度为500 fg/μL。
- 王念武王婷沈建国胡方平
- 关键词：番茄溃疡病菌锁式探针
