广东省科技计划工业攻关项目(2010B031600108)
- 作品数：8 被引量：35H指数：4
- 相关作者：芦春斌刘标杨冬宇高忱马贞丽更多>>
- 相关机构：暨南大学中华人民共和国环境保护部中国疾病预防控制中心更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目转基因生物新品种培育专项艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学生物学轻工技术与工程更多>>
- 重叠延伸PCR合成风疹病毒E1蛋白抗原肽基因及其表达
- 2012年
- 目的:利用重叠延伸PCR合成风疹病毒E1基因的抗原肽段,构建其原核表达载体并表达蛋白,为进一步获得高质量的rE1重组抗原肽奠定基础。方法:利用软件对风疹病毒E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化;设计多对寡核苷酸引物,以重叠延伸PCR法合成相应抗原肽段,克隆后测序鉴定。再以酶切连接的方法将合成的抗原肽序列克隆导入原核表达载体pET32a;利用IPTG诱导抗原肽段的表达,SDS-PAGE和West-ern blot法分析表达产物。结果:经过6轮重叠延伸PCR扩增,成功获得与预期目的序列一致的风疹病毒E1基因抗原肽并构建获得重组质粒pET32-rE1;在37℃下分别以终浓度为1 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG诱导抗原肽表达,SDS-PAGE和Western blot法检测到预期的蛋白条带;且以IPTG终浓度为1 mmol/L诱导6 h后表达量最高。结论:成功合成了密码子优化的风疹病毒E1基因抗原肽段,构建其原核表达载体pET32-rE1并表达该抗原肽。
- 芦春斌邱建阁马贞丽
- 关键词：抗原肽重叠延伸PCR
- 基于颜色判定的环介导等温扩增技术检测HPV6和HPV16被引量：9
- 2011年
- 建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的检测方法,即环介导等温核酸扩增技术(LAMP)应用于HPV6和HPV16亚型的检测。该技术设计分别对应于HPV6和16的E6和E7基因序列中6个区段的4条特异引物,在等温条件下(63℃)进行核酸扩增反应1h,在扩增前加入HNB染料(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂,以HNB染料颜色的变化做为结果判定的标准,并经LA-320实时浊度仪和琼脂糖电泳证实。文中利用这种技术对13份已知的单重感染13种HPV不同亚型的临床样本进行了特异性分析,同时对2个含目的片段的克隆质粒的系列稀释物进行了灵敏度分析。结果显示LAMP方法特异性高,颜色法判断的灵敏度均为1000个拷贝DNA分子水平,比Real-time PCR低10～20倍,对62份宫颈刮片临床标本的HPV6和HPV16检出率和HPV分型试剂盒一致。因此,基于颜色判定的环介导等温扩增方法有望应用于人乳头瘤病毒HPV6和HPV16感染的快速筛选,具有在基层疾病预防控制中心和医院推广和应用的潜力。
- 芦春斌罗乐杨梦婕聂凯王淼马学军
- 广州市农贸市场中转基因大豆的检测被引量：3
- 2012年
- 对广州市农贸市场中销售的大豆进行转基因大豆的初步筛查,以检测在广州市场是否有转基因大豆流通和销售,为相关标识和监管提供实验依据。根据转基因大豆内参凝集素Lectin基因及外源基因CaMV35S、NOS及EPSPS基因序列设计4对引物,对收集的大豆样品提取其基因组DNA后进行PCR检测。结果在所收集的14份大豆样品中检测出1份转基因大豆,表明在广州农贸市场中存在转基因大豆,并在市场流通,提醒相关部门需根据国家规定需要加强监管力度。
- 芦春斌金庆敏杨冬宇
- 关键词：转基因大豆聚合酶链式反应
- 喂食转基因大豆对子代雄鼠生殖系统的影响被引量：9
- 2013年
- 亲代小鼠分别喂食转基因和非转基因大豆饲料,120 d后组内交配获得子一代小鼠。以转基因饲料喂食的亲代所繁殖的子代小鼠作为实验组,断乳后子鼠继续喂食转基因大豆饲料;对照组子鼠为亲代非转基因喂食组所繁殖,断乳后继续喂食非转基因大豆饲料。分别于喂食30、60、90、120 d取子代小鼠的睾丸称重并计算脏器系数,伊红法染色检测精子存活率与畸形率;制作石蜡切片HE染色后观察睾丸病理学变化。结果表明:与对照组相比,实验组小鼠睾丸系数、精子存活率与畸形率均无显著性差异;组织切片镜检未发现两组小鼠的睾丸出现明显病理损伤。实验结果说明转基因大豆饲料喂食120 d未对子代雄鼠精子质量和睾丸组织病理造成影响,表明亲代长期喂食转基因大豆饲料后无潜在遗传毒性及积累效应。
- 芦春斌周文刘标
- 关键词：转基因大豆精子质量
- 转基因大豆对雄性鼠生殖系统的安全性评估被引量：9
- 2012年
- 以含转基因豆粕饲料喂食小鼠,观察对雄性小鼠生殖系统的影响。喂食小鼠120d后,通过PCR方法检测外源基因在睾丸中的存在情况;对睾丸组织制作石蜡切片,观察睾丸组织的病理损伤情况;通过流式细胞术检测睾丸组织中各生殖周期细胞比例;通过彗星电泳检测小鼠精子DNA损伤情况。结果表明:在睾丸组织中未检测到外源基因;睾丸组织切片未发现明显的病理学变化;试验组与对照组小鼠睾丸组织中各生殖周期精细胞比例无显著差异;未检测到精子DNA损伤。说明喂食转基因饲料对小鼠的生殖系统无显著影响。
- 芦春斌杨冬宇高忱刘标
- 关键词：转基因大豆小鼠生殖系统安全评估
- 重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因及其重组质粒构建
- 2010年
- 目的:利用重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因的全长序列。方法:对风疹E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化;设计多对寡核苷酸引物,以重叠PCR法分别合成该基因的3个片段,测序鉴定后以酶切连接法将各段拼接成全长为1 443 bp的RVrE1,将E1基因的全长序列克隆导入原核表达载体pET32a。结果:分别进行8轮、5轮和6轮的重叠PCR扩增,合成风疹基因3个片段;以酶切连接法将3个片段拼接成全长rE1基因并克隆入pET32a构建成载体pET32-RV rE1,PCR、酶切和测序鉴定结果表明,合成的E1基因大小、序列与预期相符;构建获得重组质粒pET32-RV rE1。结论:成功合成了密码子优化的风疹病毒E1基因并构建其重组质粒pET32-RV rE1。
- 芦春斌马贞丽
- 关键词：重叠PCR密码子优化
- 抗草甘膦转基因大豆饲料对雄性小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响被引量：12
- 2012年
- 以雄性昆明鼠为动物模型,对亲本(F0)和子一代(F1)短期(30 d)及长期(90 d)喂食抗草甘膦转基因大豆饲料后,取其脾脏,MTT法检测脾淋巴细胞增殖情况。结果表明:短期喂食实验过程中,在0、2、7、14和30 d取样时,转基因大豆饲料对亲本(F0)实验的雄性小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖均无显著性影响(P>0.05),在长期(90 d)喂食实验过程中,抗草甘膦转基因大豆饲料对亲本(F0)小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖也无显著影响(P>0.05)。同样,在30 d的短期和90 d的长期喂食实验过程中,抗草甘膦转基因大豆饲料对子一代(F1)雄性小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖也均无显著抑制作用(P>0.05)。表明短期(30 d)及长期(90 d)喂食含抗草甘膦转基因大豆饲料对亲本及子一代雄性小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖均无显著性影响,且无遗传积累效应。
- 芦春斌张伟刘标
- 关键词：抗草甘膦转基因大豆雄性小鼠MTT脾细胞增殖
- 重叠PCR合成HPV16 E6、E7基因并构建植物表达双元载体被引量：1
- 2011年
- HPV16型为主的多种HPV病毒可诱发机体发生宫颈癌等疾病,以重叠PCR法人工合成HPV16 E6、E7致癌基因的融合基因,以之为目的基因构建了无选择标记基因(Marker-Free)双元载体,期望转化番茄开发新型宫颈癌治疗性疫苗-转基因植物口服疫苗。通过生物信息学分析HPV16 E6、E7基因,设计并合成密码子优化的靶基因E6-E7融合基因;并在目的基因的上游引入分子佐剂LTB基因,与Kozak序列等表达元件相偶联,以提高目的基因在植物表达系统的表达水平、增强其诱导黏膜免疫的免疫原性。目前已构建pX6-LTB-E7和pX6-LTB-E7-E6两个番茄转化双元载体。采用番茄Marker-Free系统转化和表达HPV16 E6、E7目的基因可以在转化后代中剔除标记基因,从而消除由标记基因可能引起的转基因植物口服疫苗的安全性问题,为HPV转基因植物口服疫苗应用奠定基础。
- 芦春斌高忱
- 关键词：HPV16E6E7宫颈癌重叠PCR
