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支架蛋白GIT2通过与Smad3相互作用调节其转录活性: 2014年; G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2(G protein-coupled receptor kinase interacting proteins 2,GIT2)是一种信号支架蛋白,可募集多种信号通路的关键分子,参与肌动蛋白细胞骨架组装、整合素介导的细胞粘附、G蛋白偶联受体的内化及胞内信号传递等生物学过程.采用酵母双杂交实验证明,TGF-β1信号通路的转录因子Smad3是GIT2的相互作用蛋白质,内、外源免疫共沉淀实验均证实,GIT2与Smad3存在蛋白质相互作用.报告基因实验及免疫印迹结果表明,GIT2增加Smad3的转录活性并增强TGF-β1诱导的Smad3的磷酸化.研究还发现,Git2-/-小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的Smad3磷酸化受到抑制,其骨形成相关靶基因的表达水平也低于Git2+/+小鼠.本研究表明,GIT2通过与Smad3的相互作用调节其转录活性并活化TGF-β1信号通路,可能参与调节骨髓间充质干细胞的分化.; 何东方陈慧詹轶群王建于淼杨晓明; 关键词：蛋白质-蛋白质相互作用

血浆miRNA快速制备方法建立和优化被引量：1: 2014年; 目的建立并优化用于血浆microRNA(miRNA)检测分析的miRNA快速提取方法。方法使用含表面活性剂的提取液和加热方法提取血浆miRNA,采用RNA酶抑制剂抑制RNA降解,利用检测miRNA的poly(A)加尾、逆转录反应和实时定量PCR法检测血浆miRNA表达水平,评估方法的可行性。结果成功建立了提取液和加热提取miRNA一步法,实时定量PCR结果表明该方法具有良好的扩增特异性、可重复性,方法稳定可靠。结论提取液和加热一步法简便、快速、低成本,血浆用量少,为临床血浆miRNA检测分析提供了一种新的技术方法。; 李函蔚钟一然付汉江铁轶朱捷李桂英郑晓飞; 关键词：血浆微RNA

肝活素(HPS)——一种新的小鼠急性肝损伤标志物被引量：3: 2015年; 目的急性肝衰竭是目前临床上导致死亡的重要病因之一,研究具有肝特异性、灵敏度高的肝损伤标志物对于严重肝病的早期诊断以及预后预测具有重要的意义。肝活素(hepassocin,HPS)是一种具有高度组织特异性的促肝细胞增殖活性因子,在动物水平检测其在血清中的表达水平与肝损伤程度的相关性将为其开发成临床检测急性肝损伤的特异性标志物奠定基础。方法利用腹腔注射不同剂量CCl4处理诱导小鼠急性肝损伤模型,检测小鼠的存活率、转氨酶水平以及肝病理变化。通过ELISA检测小鼠血清的HPS水平;实时PCR法检测HPS mRNA水平;Western印迹法检测HPS的蛋白表达水平。结果随着CCl4处理剂量的增加,小鼠死亡率显著升高,肝损伤程度显著增加,在此过程中,HPS在小鼠血清及肝组织中的表达水平也显著上调,并与肝损伤程度密切相关。结论HPS可做为一种新的小鼠肝损伤标志物。; 翟华立陈慧詹轶群杨晓明于淼; 关键词：肝损伤肝功能衰竭标志物转氨酶类胆红素

构建定向T载体用于基因克隆和表达被引量：10: 2013年; 传统的T载体克隆方法需要烦琐的后续步骤来筛选和鉴定重组子,并且无法实现目的基因的定向克隆。为了克服这些问题,本研究在pET-23a(+)的基础上构建了定向T载体pETG,首先通过定点诱变消除pET-23a(+)上的两个BfuⅠ位点得到PET-23aM;设计一对引物在5端各引入一个BfuⅠ位点,下游引物紧邻BfuⅠ位点引入13 bp的部分LacO序列,用该引物从pHBM2002上扩增Prrn-gfp表达盒,插入PET-23aM的NdeⅠ和XhoⅠ位点,得到定向T载体pETG。PCR扩增的目的基因通过下游引物引入7 bp剩余的LacO序列,该基因片段与BfuⅠ酶切制备的定向T载体连接、转化大肠杆菌DH10β感受态细胞,通过补加了X-gal的平板筛选蓝色重组子。质粒酶切和PCR鉴定表明蓝色菌落全部为定向插入的重组子,重组效率100%,利用本方法成功地定向克隆了103个人类肝蛋白编码基因cDNA,克隆过程无需复杂的步骤筛选鉴定重组子。随机选择了其中的8个基因的克隆进行表达,结果显示8个克隆均在大肠杆菌中获得成功表达。该结果表明定向T载体构建成功,并且该载体非常适合基因的克隆和表达。; 钟星翟超陈亮余晓岚蒋思婧严红杨登想马立新; 关键词：TA克隆 PCR克隆蛋白质表达

GPS2基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞的永生化及其增殖凋亡的检测被引量：1: 2016年; 目的利用SV40大T抗原(SV40LT)过表达慢病毒建立永生化的GPS2野生与敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)系,并检测GPS2敲除对MEF增殖及凋亡的影响。方法构建p CDH-Flag-SV40LT-GFP慢病毒表达载体,并进行病毒包装。分离胚胎发育9.5 d(E9.5d)的MEF细胞,感染SV40LT慢病毒,连续传代培养50代以上,把仍存活且状态良好的GFP阳性细胞视作永生化成功的MEF细胞。利用高内涵细胞成像分析仪检测永生化MEF细胞的增殖情况,采用AnnexinⅤ/PI双染色、流式细胞仪检测细胞凋亡。结果成功构建p CDH-Flag-SV40LT-GFP慢病毒表达载体,获得滴度为4.03×108pfu/ml的病毒。分离E9.5d MEF细胞并感染上述病毒,阳性细胞扩大培养并稳定传代50代以上,成功建立了永生化的MEF细胞系。GPS2敲除MEF细胞的增殖能力明显低于野生型,而二者由于血清撤除所引起的凋亡并无明显差异。结论敲除GPS2抑制MEF细胞的增殖。; 田欢欢任广明詹轶群杨晓明尹荣华; 关键词：成纤维细胞永生化细胞增殖

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全球变化研究国家重大科学研究计划(2013CB910801)