国家自然科学基金(31000628)
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- PCNA蛋白突变体的真核表达载体构建及鉴定
- 2012年
- 目的构建带FLAG标签的细胞增殖核抗原(PCNA)蛋白Y211A、Y211D突变型重组质粒,真核表达及鉴定。方法以FLAG-PCNA野生型基因为模板,运用PCR定点突变技术扩增出带突变位点的基因序列,将其插入真核表达载体pCMV-N-FLAG,进行双酶切实验和测序验证。然后,利用脂质体将重组质粒转染至293T细胞,Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果 FLAG-PCNA(Y211A)、FLAG-PCNA(Y211D)重组质粒测序结果正确,获得PCNA蛋白突变体。结论成功构建了带FLAG标签的PCNA蛋白Y211A、Y211D真核表达载体,验证了突变型PCNA融合蛋白的表达,为PCNA蛋白功能的深入研究奠定了基础。
- 刘小会淡松松秦焕焕高学娟刘朗夏
- 关键词：PCNA蛋白突变体真核表达
- UV照射和MMS诱导下PCNA表达的变化及相关研究
- 2014年
- 目的:建立DNA损伤的模型,在蛋白水平和mRNA水平研究PCNA的表达变化情况。方法:UV照射和MMS处理细胞后利用Western blot和实时荧光定量PCR检测PCNA蛋白表达水平和mRNA水平的变化,以及利用倒置荧光显微镜观察细胞的形态变化。运用ShRNA干扰技术降低泛素E3连接酶RAD18和CUL4A的表达,检测内源PCNA蛋白表达水平的变化。结果与结论:UV照射和MMS处理细胞后,细胞形态发生变化,随着时间的延长,大部分细胞趋于死亡。实时荧光定量PCR的结果发现PCNA的mRNA水平下降,但是PCNA蛋白水平的表达无明显变化,说明DNA损伤时PCNA蛋白的稳定性增加,暗示细胞中存在着一定的机制,维持PCNA蛋白表达量的稳定。干扰E3连接酶CUL4A和RAD18的表达时,PCNA蛋白水平有所升高,提示二者参与了PCNA的降解过程。
- 谢颖颖汤冬娥刘小会高学娟刘朗夏
- 关键词：PCNADNA损伤UVMMS
