国家自然科学基金(30800813)
- 作品数：12 被引量：46H指数：4
- 相关作者：陈创夫王远志唐利燕葛阳春杜军伟更多>>
- 相关机构：石河子大学教育部中国动物卫生与流行病学中心更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划兵团博士基金更多>>
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- 实时定量PCR检测siRNA对小鼠巨噬细胞中FTH1基因表达的抑制作用被引量：1
- 2010年
- 目的通过实时定量PCR(real-ti me PCR)检测基因表达的mRNA,建立一种直接观察小干扰RNA(si RNA)抑制目的基因表达的方法。方法化学设计合成对应于FTH1(ferritin heavy chain1,FTH1)基因表达mRNA的si RNA,经TurboFectTMin vitro Transfection Reagent转染小鼠RAW264.7巨噬细胞,48h后,提取总RNA,逆转录为cDNA。以3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参,定量检测FTH1的表达,比较干扰前后FTH1基因mRNA的量。结果 3种si RNA处理的小鼠巨噬细胞中FTH1基因的表达抑制率最高为97.60%。结论实时定量PCR方法的建立为研究布鲁氏菌在侵染巨噬细胞过程中FTH1的功能提供了有效途径。
- 杜军伟王远志陈创夫葛阳春唐利燕
- 关键词：实时定量PCRSIRNA
- 布鲁杆菌BP26重组卡介苗的构建及对小鼠CD4＋和CD8＋T细胞的影响被引量：3
- 2012年
- 目的构建预防布鲁杆菌病的新型疫苗——布鲁杆菌BP26重组卡介苗（rBCG—BP26），观察rBCG—BP26对免疫小鼠CD4＋．CD8＋T细胞的影响。方法利用常规分子生物学技术构建重组穿梭分泌载体pMV261-Ag85B—BP26，电转入卡介苗（BCG）后经过卡那霉素抗性筛选，对获得的基因重组株进行PCR鉴定。采用Western免疫印迹法检测菌体和液体培养基中BP26蛋白表达情况。选用45只BALB／c小鼠进行安全性实验分析，将其分成3组：目标实验（rBCG—BP26）组、阳性对照（BCG）组、阴性对照（PBS）组，每组15只。分别在小鼠皮内接种100μl rBCG—BP26[含106克隆形成单位（CFU）]、BCG、PBS。观察各组小鼠体征，在小鼠免疫后的第10、20、30、40天称量体质量，并于尾部采血，用流式细胞仪分析CD4＋,CD8＋T细胞含量。结果成功构建rBCG—BP26重组疫苗株。在菌体和液体培养基中均能检测到BP26蛋白的表达。安全性实验分析表明，3组小鼠在免疫后第10、20、30、40天体质量比较，差异无统计学意义[rBCG—BP26组分别为（19．16±0．55）、（20．89±O．20）、（22．15±0．76）、（24．60±0．64）g；BCG组分别为（19．90±0．02）、（21．53±1．57）、（21．95±0．55）、（24．70±0．39）g；PBS组分别为（19．24±0．54）、（21．37±0．66）、（22．83±0．62）、（25．06±0．37）g；F值分别为2．468、0．331、1．520、0．739，P均〉0．05]。在免疫后第10、20天时，rBCG—BP26组小鼠全血CD4^＋T细胞含量（13．40％、26．70％）低于BCG组（26．70％、33．07％）和PBS组（33．85％、29.33％），rBCG—BP26组CD4＋／CD8＋T细胞含量比值随时间延长而逐渐增长（0．69％、1．27％、1．57％、1．70％）。结论rBCG-BP26能高效表达布鲁杆菌BP26蛋白，并具有毒力弱、能激活机体CD4＋、CD8＋T细胞的特点，可作为预防布鲁杆菌病的疫苗候选株之一。
- 诸婷婷张璘陈创夫王远志柳建新王慧
- 关键词：布鲁杆菌疫苗卡介苗
- 绵羊附睾种布鲁氏菌019株外膜蛋白基因序列比较研究被引量：2
- 2010年
- 目的证实新疆分离绵羊附睾种布鲁氏菌019株与参考菌株的差异性。方法采用PCR扩增绵羊附睾种布鲁氏菌019株外膜蛋白的Omp31、Omp25、Omp22、Omp2a、Omp2b基因,并进行序列比较分析。结果绵羊附睾种布鲁氏菌019株的5种外膜蛋白基因序列与绵羊种布鲁氏菌参考株在核苷酸水平和氨基酸水平上均存在差异。结论绵羊附睾种布鲁氏菌019株是独特的新疆地方株。
- 王远志陈创夫崔步云曹旭东张辉
- 关键词：外膜蛋白基因PCR
- 铁蛋白重链多肽对RAW264.7细胞中凋亡相关基因表达的影响被引量：4
- 2010年
- 为了探讨铁蛋白重链多肽(ferritin heavy chain 1,FTH1)对RAW264.7细胞中凋亡相关基因表达的影响,采用RNA干扰和实时定量方法进行研究,首先提取RAW264.7细胞的总RNA,应用反转录PCR获得定量片段,制定标准曲线。将pSIREN-FTH1A/B转染到RAW264.7细胞,48 h后用绵羊种布鲁氏菌019株侵染4 h,实时定量PCR检测凋亡相关基因Mkl1、Birclb的表达,GAPDH作为内参基因,检测干扰前后凋亡相关基因mRNA的量。结果显示:转染pSIREN-FTH1的细胞被布鲁氏菌侵染后,Mkl1、Birclb基因mRNA的量较干扰前分别降低了76.3%、88.8%。FTH1可调节凋亡相关基因表达从而影响细胞凋亡的进程。
- 杜军伟王远志陈创夫葛阳春
- 关键词：布鲁氏菌巨噬细胞凋亡
- 山羊痘病毒双向启动子序列的克隆与鉴定被引量：2
- 2011年
- 为鉴定山羊痘病毒(GPV)基因组中的启动子序列,本研究预测GPV基因组中早期转录因子VETF-l和中期转录因子VITF-3基因序列之间56 bp的一段序列为双向启动子,并将其命名为Pb56。通过PCR技术将该启动子序列的两个方向(Pb56+,Pb56-)分别与绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因融合,构建重组转移重组质粒,分别命名为pUC-TK12-Pb56(+)-EGFP和pUC-TK12-Pb56(-)-EGFP。用脂质体转染法将2个转移重组质粒以及阴性对照pUC-TK12-EGFP及阳性对照pUC-TK12-P7.5-EGFP分别转染GPV预感染的BHK细胞;采用EGFP报告基因的表达水平评估双向启动子的活性。结果表明该基因序列的两个方向均能启动EGFP的表达,初步证实了该基因序列为GPV的双向启动子;Pb56+和Pb56-的转录活性均高于痘苗病毒的P7.5启动子。
- 张娜张辉胡圣伟王安涛张沾陈创夫乔军
- 关键词：双向启动子报告基因转录活性
- 布鲁杆菌M5-90△bp26基因缺失株的构建与免疫原性的比较研究
- 2013年
- 目的构建布鲁杆菌M5-90△bp26基因缺失株，对比观察其免疫原性与M5—90亲本株的区别，研制毒力弱、安全性能好并能进行鉴别诊断的布鲁杆菌弱毒候选苗。方法利用常规分子生物学技术构建布鲁杆菌M5-90△bp26基因缺失株并进行遗传稳定性检测和常规细菌学性质鉴定；用1．0×10^9CFU／2Inl剂量的M5—90亲本株和M5-90△bp26基因缺失株分别免疫绵羊，所得血清与纯化的BP26蛋白进行Westernblot免疫印迹实验，比较M5—90Abp26基因缺失株与M5—90亲本株在体液免疫中对BP26蛋白识别上的差异；用试管凝集试验（SAT）检测受试绵羊不同时期（0、7、14、21、30、45d）的血清效价；安全性试验用1．0×10^6、6．0×10^6、2．0×10^7CFU／O．2ml的M5-90亲本株和M5-90△bp26基因缺失株分别免疫接种小鼠，观察、记录小鼠接种疫苗后的临床症状和死亡情况，比较二者的毒力。结果遗传稳定性检测M5—90亲本株PCR扩增出长度约1279bp的片段，而2—15代的M5-90△bp26基因缺失株扩增出长度约629bp的片段，后者测序结果表明出现bp26基因650bp的缺失；常规细菌学性质鉴定结果，M5-90△bp26由M5—90亲本株的单因子血清试验M型转变为R型，BK2噬菌体裂解实验由阳性转变为阴性，鉴定为深度变异菌株；Westernblot免疫印迹实验表明M5—90△bp26基因缺失株免疫绵羊所获得的血清与纯化的BP26蛋白不发生反应，而M5—90亲本株可发生反应；STA试验表明M5-90△bp26基因缺失株诱导绵羊产生抗体水平（1：50）明显低于M5—90亲本株（〉1：800）；安全性试验表明M5-90△bp26基因缺失株毒力比M5—90亲本株明显减弱。结论成功构建M5-90△bp26基因缺失株。与M5-90亲本株比较，M5-90△bp26基因缺失株具有毒力弱、能区分自然感染与疫苗免疫的特点，可作为标记疫苗的候选株。
- 王慧唐利燕范伟兴王远志陈创夫
- 关键词：布鲁杆菌免疫原性安全性
- 布鲁氏菌bp26基因的原核表达及BP26-间接ELISA方法的初步建立被引量：15
- 2009年
- 为了表达并纯化布鲁氏菌BP26蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。方法:从布鲁氏菌疫苗株M5-90克隆bp26基因,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达,纯化BP26蛋白,进行SDS-PAGE、Western-blot检测,将纯化的BP26蛋白包被ELISA板,建立检测布鲁氏菌病的间接ELISA方法,用该方法检测42份绵羊血清,结果与标准试管凝集试验(SAT)进行比较。结果显示:正确表达并纯化了BP26蛋白,布鲁氏菌标准试管凝集试验检测的阳性率为30.85%(13/42);间接ELISA方法检测的阳性率为35.71%(15/42),二者阳性符合率为86.67%(13/ 15)。结论表达、纯化的BP26蛋白能够与布鲁氏菌阳性血清特异性结合,建立的ELISA方法比SAT方法更敏感。为以后M5-90疫苗株bp26基因缺失苗的应用提供配套性血清学检测奠定基础。
- 唐利燕陈创夫王远志张辉张红星
- 关键词：布鲁氏菌间接ELISA
- 布鲁氏菌M5-90疫苗株virB2基因缺失株的构建及鉴定被引量：14
- 2010年
- 【目的】构建布鲁氏菌M5-90疫苗株virB2基因缺失株。【方法】利用常规分子生物学技术构建自杀载体pGEM-7zf-ΔvirB2-sacB,通过同源重组的方法,将电转化后的布鲁氏菌分别经100 mg/L氨苄抗性筛选和5%蔗糖敏感性筛选,获得基因缺失株。对获得的基因缺失株进行PCR鉴定和稳定性检测。【结果】成功构建M5-90ΔvirB2基因缺失株,并且该缺失株在10代以内未发生回复突变。【结论】为研发新型布鲁氏菌弱毒基因缺失活苗奠定基础。
- 李臻张红星唐利燕陈创夫王远志
- 关键词：布鲁氏菌基因缺失株
- 羊种布鲁氏菌M5-90 omp31蛋白原核表达被引量：10
- 2009年
- 克隆、测序布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白基因OMP31,原核表达OMP31并对其检测。从羊种布鲁氏菌M5-90中PCR获得OMP31基因,连接到pBS-T克隆质粒并测序;将测序正确的基因片段克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a,进行SDS-PAGE,而后Western-blot检测。结果M5-90疫苗株的OMP31基因序列与羊种布鲁氏菌参考株16M的同源性为99.03%;外膜蛋白基因OMP31在大肠杆菌表达后能够被Western-blot检测到。结论:表达的布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白OMP31可以被布鲁氏菌特异性血清识别,表现出良好的抗原性,为以后实验室诊断和疫苗的研究做好坚实的上游工作。
- 张红星陈创夫王远志唐利燕
- 关键词：克隆测序
- 载体表达的siRNA分子对小鼠巨噬细胞galactose-specific lectin基因表达的抑制作用
- 2010年
- 目的构建小鼠巨噬细胞半乳糖特异性凝集素(GSL)靶向的RNAi质粒载体,研究其对小鼠和巨噬细胞GSL基因表达的沉默作用。方法根据GSL核苷酸序列,合成3条特异性双链小干扰RNA(siRNA)分子,退火形成双链,分别连接到RNAi-Readyp SIREN-RetroQ-ZsGreen Vector,转化大肠杆菌得到阳性克隆,经测序鉴定确认siRNA载体构建成功后,转染小鼠巨噬细胞RAW264.7及尾静脉注射BALB/c小鼠,应用实时定量PCR和免疫组化法评价siRNA载体对小鼠和巨噬细胞GSL基因表达的抑制作用。结果 siRNA载体对小鼠体内GSL基因的抑制率为84-96%,对巨噬细胞GSL基因的抑制率可达61.98%～83.02%。结论构建的siRNA载体能有效抑制目的基因在体内外的表达,该结果为分析半乳糖特异性凝集素在布鲁氏菌侵染过程中的功能奠定了基础。
- 葛阳春王远志陈创夫杜军伟胡圣伟
- 关键词：RNAI小鼠
