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重组阿拉伯糖苷酶在毕赤酵母中的分泌表达及其活性分析被引量：2: 2006年; 假密环菌是一种果树腐病菌,具有较强的分解代谢纤维素的能力。根据已克隆出的阿拉伯糖苷酶基因序列(Accession Number AJ620046)设计引物从假密环菌的mRNA中克隆出阿拉伯糖苷酶的ORF片段,构建重组质粒pPIC9-AF,与组氨酸标签融合,电转化毕赤酵母菌GS115并进行诱导表达。所得到的重组阿拉伯糖苷酶在30-35℃时有较高的酶活,最适反应活性pH值在 6．0～8．0之间,而在pH4．0～8．0范围内酶活基本保持在80％以上,比大多已报道的阿拉伯糖苷酶最适pH范围宽。对于高效表达重组阿拉伯糖苷酶以及对其进一步的酶学性质研究提供了良好的基础。; 姚冬生谭慧媚黄辉刘大岭谢春芳

耐高温耐酸稳定A.tabescens MAN47β-甘露聚糖酶体外分子定向进化: β-甘露聚糖酶(β-1,4-D-Mannanase;EC 3.2.1.78)是一类能够水解含β-1,4-D-甘露糖苷键的内切水解酶,属于半纤维素酶类,可水解半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖和甘露聚糖,产物有少...; 吴秀秀吕晓慧胡亚冬谢春芳刘大岭姚冬生; 文献传递

改进的反向PCR技术克隆丝状真菌Trametes versicolor HN0511木聚糖酶基因的侧翼序列: ＜正＞木聚糖是半纤维素中含量最丰富的组分之一,在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素,约占细胞干重的35%。它的完全降解需要多种水解酶的共同参与。β-1,4内切木聚糖酶（EC.3.2.1.8）能够以内切方式作用于木聚糖主链产生...; 吴秀秀何艳喜刘大岭姚冬生; 文献传递

耐高温耐酸稳定假密环菌(Armillariella tabescens)MAN47β-甘露聚糖酶体外分子定向进化被引量：2: 2012年; 从已经建立的易错PCR初级突变文库中筛选得到的16个兼具耐酸、高温稳定、高酶活力的克隆出发,将其作为DNA shuffling的亲本基因,利用DNA shuffling技术,结合易化筛选和96微孔板通量筛选的方法获得耐酸、高温稳定的克隆。并且,对筛选出来的耐酸高温稳定的突变子进行测序分析和同源建模,比较分析β-甘露聚糖酶突变基因序列的生物学信息。经过两轮DNAshuffling,最终筛选得到一个耐酸高温稳定突变体1108,其在90℃时酶活力还能维持在70%;在pH 3.0时酶活力维持在70%;在高温80℃和pH 4.0的条件下,酶活力是野生型的10倍;常规条件下(pH 6.0,40℃),酶活力是野生型酶的5倍。序列比对发现耐酸、高温稳定突变体1108有三个碱基发生了改变(T289A、A535T、T1085C),导致相应的氨基酸发生了改变(Ser97Thr、Val362Ala、Ile179Leu)。根据同源建模结果和氨基酸性质研究发现,突变位点位于催化中心附近,推测第97位的突变与酶的耐酸性和活性有关,第179位和第362位的突变与酶的高温稳定性有关。实验结果为进一步了解β-甘露聚糖酶MAN47的结构与功能之间的关系提供有用参考。; 吴秀秀吕晓慧胡亚冬谢春芳刘大岭姚冬生; 关键词：定向进化 Β-甘露聚糖酶 DNA SHUFFLING

基于易错PCR的假密环菌Armillariella tabescens MAN47 β-甘露聚糖酶耐高温定向进化被引量：6: 2009年; 本研究利用易错PCR技术突变假密环菌Armillariella tabescens MAN47 β-甘露聚糖酶野生型基因,PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体pYCα上连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后电转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,构建了库容为104的初级突变体库,筛选得到耐高温最佳突变株M262。DNS法测得80oC处理30min后最大酶活力为25U/mL,较之野生型最适条件酶活力提高了4.3倍。序列分析表明,突变体有3个碱基发生了突变:T343A/C827T/T1139C,相应的氨基酸改变为Ser115Thr/Thr276Met/Val380Ala,利用SWISS-MODEL数据库同源建模显示,这3个突变氨基酸分别位于第4个β折叠的第6个氨基酸、第6个α螺旋的第1个氨基酸、第10个α螺旋和第11个β折叠之间的转角。; 吕晓慧胡亚冬胡凤娟刘大岭姚冬生; 关键词：定向进化 Β-甘露聚糖酶易错PCR 热稳定性

基于生物催化与分子结构评价的A. tabescens β-甘露聚糖酶MAN47胰蛋白酶抗性的分子理性设计: ＜正＞为了避免分子定向进化非理性设计所带来的海量筛选,理性设计是酶蛋白质改造的有效方法,但其需要在了解蛋白分子结构与其功能之间的关系基础上,才能有目标的选取突变位点,对酶蛋白进行改造。突变位点的选择,通常需要分子结构与功...; 胡凤娟王旭曼苏建华黎玉凤刘大岭姚冬生; 文献传递

Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶atMAN47的纯化及酶学性质分析被引量：2: 2009年; 以魔芋精粉为唯一碳源，对假蜜环（Armillariellatabescens）EJLY2098进行培养，诱导其产生β-甘露聚糖酶。经DEAE一阴离子交换层析后，分离纯化出β-甘露聚糖酶atMAN47。酶学性质分析：该酶分子量约为47kD，酶的最适反应温度为50℃，在pH5．0～6．5之间该酶的稳定性较好；Na＋和Ba2＋对该酶有激活作用，用TLC对酶产物分析，表明该酶为内切β-甘露聚糖酶。该酶为偏酸性的内切甘露聚糖酶，适合发展为饲料的酶制剂，具有良好的应用前景。; 何艳喜宋影曹红刘大岭姚冬生; 关键词：Β-甘露聚糖酶纯化酶学性质

毛霉Amylomyces.rouxii HN0512中内切葡聚糖酶的诱导、纯化及性质分析被引量：1: 2011年; Amylomyces.rouxii HN0512经羧甲基纤维素钠(CMC-Na)诱导,可产内切葡聚糖酶,通过正交试验优化诱导培养基,结果在培养基为1%羧甲基纤维素钠、2%麸皮汁、0.2%蛋白胨(以上均为质量分数)时可以诱导出较高活性的酶,用HiTrap QFF阴离子交换层析从培养液上清中纯化得到了具有内切葡聚糖酶活性的P3组分,活性组份的SDS-PAGE分析电泳呈现一条带,经AlphaEaseFCTM软件预测P3的分子质量为18.7 ku;酶反应的最适温度和pH分别为60℃和5.0,在pH 4.0-7.0范围内稳定性最好,在70℃还能保持50%以上的酶活力;金属离子Fe3+、Ba2+、Fe2+和表面活性剂尿素对酶起到了激活作用;反应动力学参数Km和Vmax分别为11.68 mg.mL-1、0.56μmol.L-1.min-1.本研究获得了一株产内切葡聚糖酶新菌种,并为进一步用基因工程方法克隆并构建重组内切葡聚糖酶基因工程菌奠定了重要的基础.; 管明斌王艳凤谢春芳姚冬生; 关键词：羧甲基纤维素钠内切葡聚糖酶纯化

具蛋白酶抗性的Armillariella tabescens β-甘露聚糖酶MAN47的分子定向改造被引量：6: 2011年; 利用定点突变的方法提高Armillariella tabescensβ-甘露聚糖酶MAN47的胰蛋白酶抗性。首先根据其氨基酸序列,找到胰蛋白酶的水解位点—赖氨酸(Lys,K)和精氨酸(Arg,R),再利用生物信息学软件获得酶分子结构中K和R与周围溶剂的接触程度,选定暴露程度最大的K280为候选突变位点,进行模拟突变,并分析突变前后的氢键键长和整体结构的变化。根据氢键键长的变化,确定突变体为K280N。对K280N设计突变引物,用重叠延伸PCR技术对MAN47野生型man基因进行突变,PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体PYCα连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,经人工肠液(pH 6.8 10mg/ml胰蛋白酶溶液)筛选,得到抗胰蛋白酶的最佳突变株。结果表明突变酶在用人工肠液处理180min后,其半衰期为173min,而野生型酶为99min,其他酶学性质与野生型酶基本一致。; 胡凤娟王旭曼刘大岭姚冬生; 关键词：定点突变 Β-甘露聚糖酶重叠延伸PCR 同源建模分子计算

Armillariella tabescens阿拉伯糖苷酶基因全长cDNA的克隆与表达被引量：1: 2006年; 通过对假密环菌(Arm illariella tabescens)的表达cDNA克隆文库进行随机测序,获得一段与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列同源性很高的EST序列(AJ620046).根据获得的EST序列用SMART-RACE技术成功从假密环菌中克隆出了阿拉伯糖苷酶基因的全长cDNA,用生物信息学的方法对所获的序列进行信息学分析.分析结果显示其全长cDNA为1 016 bp,其最长的开放阅读框架为924 bp,编码307个氨基酸,该全长cDNA序列与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列具有较高同源性,80~279位氨基酸序列属于阿拉伯糖苷酶超家族,58~184位氨基酸是一个典型的结构功能域,蛋白分子质量预测为32 881 u,等电点为4.59.构建重组质粒pPIC9-AF,并在毕赤酵母菌GS115中对所获得的基因进行了表达,相对酶活达到了81.25%.; 谢春芳黄辉姚冬生刘大岭梁郁强; 关键词：阿拉伯糖苷酶生物信息学

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广东省科技攻关计划(2005B20601004)

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