国家自然科学基金(31000799)
- 作品数：7 被引量：28H指数：4
- 相关作者：汤晓艳颜成英王敏龚艳陈明更多>>
- 相关机构：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所南京农业大学中国检验检疫科学研究院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技支撑计划国家现代农业产业技术体系建设项目更多>>
- 相关领域：轻工技术与工程生物学理学农业科学更多>>
- 猪背最长肌PFK-2/FBPase-2荧光定量RT-PCR方法的建立被引量：2
- 2014年
- 为研究糖酵解关键酶果糖-6-磷酸-2激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase,PFK-2/FBPase-2)基因转录水平与宰后肉品质间的关系,根据猪PFK-2/FBPase-2 mRNA序列(GenBank登录号:NM_001143721.1)设计一对特异性引物并选择β-actin作为内参基因,构建含有各自序列的重组质粒标准品,通过对反应条件的优化,建立了荧光定量实时-聚合酶链式反应技术检测猪PFK-2/FBPase-2基因转录水平的方法。结果表明,所建立的方法线性关系好,目的基因与内参基因R2均大于0.999;灵敏度高,两基因检出下限均为10拷贝/μL;特异性好,扩增产物均有特异性单一峰。同时根据标准曲线计算可知目的基因与内参基因的扩增效率分别为104.5%和104.0%,扩增效率接近一致,可对PFK-2/FBPase-2转录水平进行相对定量。本研究选取PSE肉产生程度不同的三元杂交猪、杜洛克猪和太湖猪,利用建立的方法对不同品种猪宰后45 min背最长肌中PFK-2/FBPase-2 mRNA转录水平进行测定,结果表明,太湖猪转录水平最高、杜洛克次之、三元杂交猪最低,且3个品种间有显著性差异(P<0.05)。
- 李朋颖汤晓艳王敏康大成颜成英
- 关键词：MRNASYBR
- 离子色谱法检测生鲜肉中二氧化氯及其副产物被引量：4
- 2013年
- 建立一种用离色谱法同步检测生鲜肉消毒残留的二氧化氯(ClO_2)及其降解副产物亚氯酸根(ClO_2^-)、氯酸根(ClO_3^-)含量。样品经0.05mol/L的磷酸盐缓冲液(pH4.3)-乙腈(50:50,V/V)提取,向离心后的上清液中加过量的亚硝酸根(NO_2^-)反应,氢氧化钙溶液调节pH值至7～8,并沉淀杂质离子,正己烷除脂,采用AS11-HC色谱柱分离,15mmol/L KOH溶液以1.0mL/min流速等度淋洗,电导检测器检测,外标法定量。本方法得出ClO_2、ClO_2^-、ClO_3^-的最低检出限分别为0.5、0.7、0.5mg/L,定量限分别为1.0、1.2、1.0mg/L。结果表明利用IC法检测生鲜肉中ClO_2、ClO_2^-、ClO_3^-含量,方法准确、可靠、实用性强。
- 陈东宇汤晓艳孙京新王敏金芬毛雪飞
- 关键词：离子色谱法生鲜肉CLO2
- 猪TIGAR mRNA SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立
- 2014年
- 根据GenBank中猪TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)mRNA序列(登录号:XM_001926543),设计合成了1对特异性引物,通过对反应条件的优化,建立了荧光定量RT-PCR技术检测猪TIGAR基因转录水平的方法,同时对长白猪宰后不同时间TIGAR mRNA转录水平进行了测定。结果表明,所建立的TIGAR基因标准曲线的R2为0.9995,内参基因β-actin标准曲线的R2为0.9996,2基因的扩增效率分别为103.7%和104.1%,扩增效率接近一致,可对TIGAR mRNA转录水平进行相对定量。该方法特异性强、灵敏度高,具有一定应用价值。
- 康大成汤晓艳李朋颖颜成英范成明
- 关键词：MRNASYBRRT-PCR
- 鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白提取及多抗制备被引量：2
- 2014年
- 鼠伤寒沙门氏菌是沙门氏菌属常见致病菌,其鞭毛蛋白具有抗原性,可诱导免疫系统产生针对该蛋白的抗体。实验采用直接提取法获得鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白,并以该蛋白为抗原免疫小鼠,制备鞭毛蛋白多抗,使用间接ELISA方法测定多抗的效价和特异性。SDS-PAGE实验结果表明,蛋白条带单一,分子量大小为57ku,说明提取的鞭毛蛋白是目标蛋白且纯度较高;间接ELISA检测结果表明,制备多抗的效价为1∶102400,除与猪霍乱沙门氏菌发生交叉反应外,与其他6种沙门氏菌和6种常见非沙门氏菌属的致病菌均不发生反应,说明该抗体的效价较高,特异性较好,可以用于与磁珠的偶联,为免疫磁珠的制备打下基础。
- 颜成英汤晓艳王敏康大成李朋颖龚艳
- 关键词：鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白多抗
- 肠炎沙门氏菌EMA-PCR检测方法的建立被引量：6
- 2014年
- 将荧光染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide,EMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测技术相结合,用于肠炎沙门氏菌活菌的检测。实验参数优化结果表明,当EMA终质量浓度50μg/mL、曝光时间10 min时,可以抑制约107 CFU/mL肠炎沙门氏菌死菌DNA的扩增;活菌灵敏度检测结果显示,EMA-PCR方法检测限与单一PCR方法一样均为27.5 CFU/mL,说明EMA处理既不会影响活菌DNA的扩增也不会影响PCR方法的灵敏度。利用EMA-PCR方法检测死活混合菌液时发现,添加EMA的实验组DNA条带亮度会随着活菌比例的降低而变暗,且当样品中全是死菌时,没有目标条带出现;而不添加EMA的对照组DNA条带亮度没有变化,当样品中全是死菌时,目标条带依然清晰可见。说明添加EMA可以达到区分死活菌的目的,EMA-PCR方法只检测样品中的活菌,避免了死菌DNA造成假阳性的可能性。
- 颜成英汤晓艳王敏康大成李朋颖郑锌
- 关键词：聚合酶链式反应肠炎沙门氏菌
- EMA RT-PCR法检测鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌活菌被引量：8
- 2015年
- 目的:叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bromide,EMA)具有特异性抑制死菌DNAPCR扩增而对活菌细胞无影响的特点,将其应用于鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌活菌检测。方法:待测样品中加入EMA至终质量浓度为50μg/m L,卤素灯曝光处理10 min,提取DNA进行RT-PCR反应,根据Ct值和标准曲线计算样品中活菌的数量。结果:相同细胞浓度条件下,活菌经EMA处理后其Ct值与未经EMA处理组的Ct值无显著性差异(P>0.05),且细胞浓度与Ct值均呈显著负相关性,相关系数分别是0.9916和0.9832;死菌经EMA处理后其Ct值与活菌经EMA处理后的Ct值有显著性差异(P﹤0.05),而与阴性对照组无显著性差异(P>0.05);死/活鼠伤寒沙门氏菌混合菌液污染鸡肉样品检测结果显示,与直接RT-PCR方法相比,EMART-PCR方法的检测结果更接近于平板计数结果。结论:EMA与RT-PCR相结合的方法可以快速、准确地检测鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌活菌的数量,避免假阳性结果,具有实用意义。
- 颜成英汤晓艳康大成李朋颖龚艳
- 关键词：逆转录-聚合酶链式反应鼠伤寒沙门氏菌鸡肉
- 鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备被引量：8
- 2013年
- 利用PCR扩增出鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因fliC,连接到原核表达载体pET28a(+)上,测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,构建了原核表达系统。经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导及Ni-NTA纯化后,得到了带6×His纯化标签的分子质量大小约为54.6kD的表达产物,和预测蛋白大小一致,且大部分表达产物以可溶形式存在利用Western-blotting进一步鉴定,结果表明,该蛋白能与抗His标签的单抗发生特异性反应。用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,获得多克隆抗体,并对抗血清的效价和特异性进行检测,结果表明,多抗的效价较高,特异性较好。
- 陈明徐幸莲周光宏汤晓艳袁飞陈爱亮
- 关键词：鼠伤寒沙门氏菌原核表达纯化多克隆抗体
