江苏省自然科学基金(BK2006242)
- 作品数：7 被引量：11H指数：3
- 相关作者：曾晓燕焦永军郭喜玲史智扬史凤娟更多>>
- 相关机构：江苏省疾病预防控制中心南京农业大学南京医科大学更多>>
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- 肠出血性大肠杆菌O157∶H7志贺毒素I型A亚基的表达与鉴定被引量：2
- 2014年
- 目的表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7志贺毒素1型A亚基(Stx1A)重组蛋白并鉴定。方法从EHEC O157∶H7基因组中扩增编码Stx1A的基因,经测序无误后,克隆入表达载体pET-22b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导、纯化获得目的蛋白Stx1A,并对纯化的目的蛋白进行质谱鉴定。重组的Stx1A蛋白免疫BALB/c小鼠,观察小鼠抗血清与EHEC O157∶H7毒株特异性反应。结果 PCR扩增的Stx1A基因为945 bp,成功构建重组质粒pET22b(+)-Stx1a,重组蛋白在原核细胞中获得高效表达,通过AKTATM-His亲和层析柱获得纯化。质谱分析表明目的蛋白为Stx1A。Western blot显示鼠抗Stx1A血清可与EHEC O157∶H7毒株产生的天然毒素蛋白结合。结论成功克隆了EHEC O157∶H7 Stx1A基因,并获得重组表达,为后续研究奠定基础。
- 黄明明曾晓燕史凤娟张黎李祥瑞焦永军
- 关键词：H7
- Ⅱ型志贺毒素单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的表达和功能鉴定
- 2010年
- 目的从分泌抗肠出血性大肠埃希菌Ⅱ型志贺毒素中和单克隆抗体杂交瘤细胞株S2C4中克隆抗体可变区基因，构建单链抗体（ScFv），进行原核表达，并对其功能进行鉴定。方法从杂交瘤细胞株S2C4中提取总RNA，逆转录成cDNA。在cDNA3’-OH末端添加poly．G。PCR扩增包括5’非翻译区和信号肽序列在内的抗体重、轻链可变区基因VH和VL,PCR产物装入T—A载体测序。根据测序结果，设计引物分别扩增VH和VL编码区，再通过重叠PCR，在VH和VL．编码区基因之间引入连接链，构建Scn基因，并克隆到表达载体pComb3xSS中。重组载体导入E．coliTop10F’进行表达，重组蛋白经纯化后，分别用ELISA和动物保护性实验鉴定其生物学活性。结果VH和VL编码区基因全长分别为396bp和378bp，ScFv基因能在大肠埃希菌中高效表达，表达产物的分子量为34000，用NiSO4亲和层析柱成功纯化。功能性实验表明纯化的重组蛋白可以与Stx2毒素有效结合，能保护动物抵御毒素分子的攻击。结论成功地克隆S2C4单抗可变区基因，并构建、表达其单链抗体ScFv，为下一步进行该抗体人源化奠定实验基础。
- 郭喜玲吴涛曾晓燕张晓陈银史智扬詹峰金秋焦永军
- 关键词：单克隆抗体单链抗体
- 肠出血性大肠杆菌Ⅱ型志贺毒素A亚单位单克隆抗体S1D8的制备和初步应用被引量：4
- 2008年
- 目的:制备肠出血性大肠杆菌(EHEC)Ⅱ型志贺毒素(StxⅡ)A亚单位单克隆抗体,探讨用特异性抗体检测EHEC志贺毒素的可行性。方法:通过基因工程操作制备了EHEC StxⅡA亚单位蛋白-StxⅡA,StxⅡA免疫小鼠制备鼠源单克隆抗体;对获得的抗体S1D8克隆的特异性用Western blot验证;最后用单抗S1D8制备亲和层析柱纯化StxⅡ,用志贺毒素检测试剂盒验证其特异性。结果:成功表达、纯化StxⅡA-GST融合蛋白;从融和的杂交瘤中筛选出一株特异性抗体克隆并命名为S1D8,S1D8在Western blot中可以与StxⅡ的A亚单位特异性结合,用S1D8亲和层析柱从EHEC的培养上清液中纯化了StxⅡ,在胶体金检测试验中StxⅡ阳性。结论:单克隆抗体S1D8的制备为基于毒素分子作为靶分子的EHEC免疫诊断、治疗研究奠定了基础。
- 曾晓燕焦永军郭喜玲吴涛陈银史智扬
- 关键词：肠出血性大肠杆菌
- 肠出血性大肠埃希菌O157：H7Ⅱ型志贺毒素的纯化及功能鉴定被引量：4
- 2008年
- 目的亲和层析纯化肠出血性大肠埃希菌（EHEC）O157：H7Ⅱ型志贺毒素，并鉴定其生物学功能。方法用抗-Ⅱ型志贺毒素分子A亚单位的抗体S1D8耦联至柱填料Sepharose 4B，制备亲和层析柱。纯化EHEC O157：H7菌体分泌的毒素分子，分别用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western印迹法鉴定毒素分子纯度和特异度，将纯化毒素倍比稀释，观察其对Vero细胞和小鼠的毒性作用，计算其对细胞半数致死量（CD50）和对小鼠的全数致死量（LD100）；观察抗毒素血清对小鼠进行毒素攻击的保护作用。结果通过亲和层析从EHEC O157：H7培养物中成功纯化Ⅱ型志贺毒素。SDS-PAGE显示，其A、B亚单位的相对分子质量分别为32000和7500，纯化的毒素分子可分别与Ⅱ型志贺毒素A、B亚单位特异性的单抗结合；对Vero细胞和小鼠均存在致死作用，其CD50和LD100分别为20ng／L和5ng，小鼠体内抗毒素血清对毒素可有效中和。结论成功纯化Ⅱ型志贺毒素，并证实其在细胞和动物模型中的毒性作用。
- 焦永军曾晓燕郭喜玲汪华崔仑标李显冯振卿孙慧万佳艺史智扬
- 关键词：大肠埃希菌O157:H7志贺毒素VERO细胞疾病模型印迹法
- 应用双抗体夹心ELISA检测产志贺毒素大肠杆菌Ⅱ型志贺毒素被引量：1
- 2016年
- 目的：构建双抗体夹心ELISA检测Ⅱ型志贺毒素（ StxⅡ）,以利于产志贺毒素大肠杆菌（ STEC）感染的临床快速诊断。方法应用业已制备的StxⅡ特异性杂交瘤细胞株,筛选、鉴定最佳抗体配对,构建双抗体夹心ELISA检测体系,对16株STEC临床分离株培养上清中StxⅡ进行检测,并对该体系的特异性和敏感性进行评价。结果从获得的多株单抗分子中,成功筛选出最佳配对抗体S2D8和S2C6,构建基于S2D8/S2C6的双抗体夹心ELISA检测体系,该体系对StxⅡ纯品的检测底限是4 ng/ml,并成功从STEC培养上清中检测出StxⅡ及其变种,而与StxⅠ不结合。其检测效能与商业化胶体金试剂一致,显示出良好的敏感性和特异性。结论 S2 D8/S2 C6单抗的双抗体夹心法ELISA检测试剂的制备为基于毒素分子作为靶分子的STEC 免疫诊断、治疗研究提供基础资料。
- 史凤娟曾晓燕宋路史智扬郭喜玲焦永军
- 关键词：产志贺毒素大肠杆菌单克隆抗体双抗体夹心ELISA
- EHEC O157：H7志贺毒素Ⅱ型A、B亚单位的表达及功能鉴定被引量：1
- 2008年
- 目的克隆、表达肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157：H7志贺毒素（Shigatoxin，Stx）Ⅱ型A、B亚单位，并鉴定其免疫学功能。方法从EHECO157：H7基因组中克隆编码StxⅡ型A、B亚单位的基因，经测序、酶切后，导人表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌Top10F′，经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）-A和GST-B融合蛋白。分别用A、B亚单位融合蛋白免疫BALB／c小鼠获得高免血清，观察A、B亚单位血清对小鼠进行毒素攻击的保护作用。结果StxⅡ型A、B亚单位的GST融合蛋白获得高效表达并纯化；A、B亚单位的高免血清可以保护小鼠对致死量毒素的攻击。结论StxⅡ型A、B亚单位蛋白可以作为EHECO157：H7疫苗的候选分子，同时针对A、B亚单位蛋白的中和单抗可以对易感人群起到紧急保护作用。
- 焦永军郭喜玲史智扬曾晓燕朱进孙慧万佳艺汪华
- 关键词：B亚单位
- 产志贺毒素大肠杆菌志贺毒素Ⅰ型双抗体夹心ELISA检测方法的建立被引量：3
- 2016年
- 为建立双抗体夹心ELISA法检测产志贺毒素大肠杆菌(STEC)Ⅰ型志贺毒素(Stx1),利用重组Ⅰ型志贺毒素A亚单位(Stx1A)免疫小鼠,制备单克隆抗体,从中筛选出非竞争性的2株单抗,构建双抗体夹心法ELISA检测方法,并对试验样品中的志贺毒素进行检测。结果显示:共获得4株针对Stx1A的单克隆抗体,分别为1H2-G7、2H1-C12、8E7-E6和2F6-F8。当8E7-E6作为包被抗体,而2F6-F8作为检测抗体时,其检测毒素的OD值最高。对样品中的Stx进行检测,表明该方法只有效识别Stx1,对Stx2不识别。结论:成功建立了用于检测Stx1的双抗体夹心ELISA法,为临床上快速诊断STEC感染奠定了基础。
- 宋路曾晓燕史凤娟黄明明宋小凯李祥瑞焦永军
- 关键词：产志贺毒素大肠杆菌单克隆抗体双抗体夹心ELISA
