国家科技攻关计划(2004BA519A19)
- 作品数：7 被引量：97H指数：6
- 相关作者：刘秀梵龙进学王曲直步志高刘明更多>>
- 相关机构：扬州大学中国农业科学院哈尔滨兽医研究所东北农业大学更多>>
- 发文基金：国家科技攻关计划江苏省属高校自然科学基础研究项目国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 新城疫病毒F蛋白碱裂解位点修饰及外源基因的插入对新城疫LaSota疫苗株致病力的影响被引量：6
- 2008年
- 新城疫是危害养禽业发展的重要传染病。新城疫病毒(NDV)具有高度传染性和高致病性,融合蛋白(F)的F1/F2裂解位点存在多个碱性氨基酸并由此形成的泛组织嗜性一直以来被认为是NDV致病的主要决定因素。本研究利用已经构建NDV弱毒LaSota疫苗株反向遗传操作平台,将LaSota病毒F蛋白的碱裂解位点由GGRQGR↓L分别突变为GRRQRR↓F和GRRQRR↓L,在未加入TPCK胰酶的情况下分别成功拯救出突变修饰LaSota疫苗病毒株rL-FmF和rL-FmL,通过测定鸡胚平均致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和静脉内致病指数(IVPI)等指标对其毒力进行评估,结果rL-FmF和rL-FmL的ICPI值由LaSota的0.36分别上升为1.18和1.05,但MDT均大于90小时,IVPI仍然均为0,表明碱裂解位点的突变可显著增强致病力。为了检测外源基因插入对病毒致病力的影响,进一步以rL-FmF为载体,分别构建并拯救出表达H5亚型禽流感病毒血凝素HA和增强绿色荧光蛋白EGFP基因的重组病毒rL-FmF-HA和rL-FmF-EGFP,经测定ICPI分别为0.67和1.10,但MDT均大于90小时,IVPI仍然均为0。结果表明,对rLaSota病毒F蛋白裂解位点2个非碱性氨基酸突变为碱性氨基酸,无论F2蛋白氨基端为F或L,均可显著增强其脑内接种致病力,接近中发型毒株标准,但对静脉内接种致病能力均无显著影响,而对鸡胚致死能力均保持rLaSota病毒缓发型特点(MDT≥90);外源基因的重组、表达可不同程度致弱病毒,其致弱程度与外源基因及其表达产物性质有关。结果提示,影响NDV致病力不仅仅局限于F蛋白裂解位点氨基酸序列;通过F裂解位点修饰及HA基因插入可以获得致病力较高但基本接近缓发型标准的重组病毒。
- 王永葛金英解希帝丁玉林步志高
- 关键词：新城疫病毒裂解位点致病力
- H5N1亚型禽流感病毒NS第263~277位核苷酸缺失提高病毒对鸡的致病力被引量：14
- 2006年
- 为研究2000年以来绝大多数H5N1亚型禽流感病毒分离株在非结构基因的第263—277位发生15个碱基缺失现象的生物学意义，构建H5N1A／D／SD／04株HA、NA、NS的全基因表达／转录载体，以及NS的删除突变载体（m248），A/D/YZ/04株的NS基因表达／转录载体（848）和其补加15个核苷酸的NS突变载体（m848）。构建的载体分别与编码WSN（H1N1）内部基因载体进行组合转染，拯救获得4个具不同NS的重组的H5N1亚型流感病毒：RWSN-848和RWSN—m248在263-277位缺失15个碱基。RWSN-m848和RWSN-248则在相同位置不发生缺失。4个重组病毒的平均鸡胚繁殖效价（HA）、鸡胚的平均死亡时间（MDT）和鸡胚半数感染量（EID50）均无显著差异；但RWSN-848和RWSN-m248对6周龄SPF鸡的致病力明显高于RWSN—m848和RWSN-248。结果说明H5N1的NS基因在263～277位核苷酸发生缺失后，不影响重组H5N1在鸡胚中的繁殖性能，但提高了病毒对鸡的致病力。
- 龙进学薛峰彭宜顾敏刘秀梵
- 关键词：H5N1亚型禽流感病毒病毒拯救突变
- H5N1亚型禽流感病毒的鸭致病性研究被引量：30
- 2006年
- 【目的】为了验证H5N1亚型禽流感病毒对鸭是否具有致病作用。【方法】对2003年某地方养鹅场发病鹅群分离的一株H5N1亚型流感病毒A/Goose/HLJ/QFY/2003的生物学特性和致病性进行研究。【结果】动物实验表明该病毒对不仅对鸡具有高致病性(IVPI=3),而且对鸭也具有高致病性。雏鸭人工感染该病毒后临床表现典型的神经症状,剖检可见脑膜点状出血,肝脾肿大并见有坏死灶,肺脏严重充血、出血,消化道粘膜弥散性出血。病理组织学检查发现全身各脏器以出血、充血、细胞变性坏死和炎性细胞浸润为主要特征,并表现为不同程度的损伤。感染鸭死亡集中在感染后的4～6d,致死率75%。雏鸭在病毒感染后2～4d的气管、泄殖腔及全身各主要器官均可分离到病毒。虽然攻毒后14d耐过鸭血清中可检测到1∶16的HI抗体;但是此时胰腺中仍然可分离到低水平的病毒。【结论】本研究继从野鸟分离到对鸭具有高致病性禽流感病毒之后,首次证实家禽中也存在对鸭具有高致病性的禽流感病毒流行。
- 刘超男刘明张云刘春国高雪丽
- 关键词：禽流感病毒鸭流感H5N1亚型
- H5N1亚型禽流感病毒A/duck/Shandong/093/2004株的全基因克隆及序列分析被引量：17
- 2005年
- 应用流感病毒通用引物[4]和H5N1亚型禽流感(Avian influenza virus,AIV)的型特异性引物,成功的扩增出H5N1亚型禽流感病毒A/duck/Shandong/093/2004株(简称A/D/SD/04)的全基因序列(包括5′和3′端的非编码区序列).A/D/SD/04的基因组核苷酸全序列与18株网上公布的禽流感基因序列进行比较和分析,结果与4株鸭源H5N1的5～7个基因具99%以上的同源性;与14株H5N1有至少一个以上内部基因同源性在95%以上.与H9亚型AIV代表株A/Quail/Hongkong/G1/97(简称G1株)和A/Chicken/Beijing/1/94(简称BJ94)比较,除了非结构基因(Nonstructural gene,NS)与G1株的同源性为95.3%外,其余基因均在36.6%～92.1%之间.说明A/D/SD/04没有H9N2基因的直接整合,是H5N1毒株在自然界的重组株.推导的HA氨基酸序列分析,A/D/SD/04 的血凝素(Heamgglutinin,HA)裂解位点与比较的16株AIV的序列一致,是高致病性禽流感的分子特征(PQRERRRKKR/G),第226位氨基酸是对禽类和哺乳细胞均具有亲嗜性的蛋氨酸(Met).神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)在第48位氨基酸(颈部)后有20个氨基酸的缺失,但非结构蛋白(NS)没有在79～84氨基酸发生缺失.碱性聚合酶2(PB2)的627位氨基酸是亲禽类细胞的谷氨酸(Glu,E).结合生物学特性和分子特征,A/D/SD/04对小鼠的致病力是由多种因素决定,其可能是一株对鸡高度致病,并逐渐获得对哺乳动物致病能力的中间重组病毒.
- 龙进学王曲直卢建红刘玉良刘秀梵
- 关键词：H5N1亚型禽流感病毒通用引物全基因组序列
- 禽流感病毒NS第263～277位核苷酸缺失降低其抗干扰素能力被引量：6
- 2006年
- 2000年以来，多数H5N1亚型禽流感病毒在NS基因的263～277位发牛15个碱基的缺失。为了研究此缺失在流感病毒进化中的生物学意义，构建H5N1亚型流感病毒A／SD／04株的HA、NA、NS的全基因表达载体，以及NS基因263～277位删除的突变载体。通过反向遗传学技术，与编码WSN的其他内部基因（PB2，PB1，PA，NP和M）的表达载体进行组合转染，获得在NS基因的263～277位缺失和不缺失的2个重组H5N1亚型流感病毒（RWSN—m248和RWSN-248）。此两个重组病毒在无干扰素产生的Vero细胞上的繁殖滴度相似，在能产生干扰素的细胞MDCK和COS-1细胞上的繁殖滴度有明显差异。两个重组病毒在鸡胚中的繁殖滴，IVPI，MDT和EID50均无显著差异。说明NS基因的263～277位核苷酸的缺失不影响病毒的整体毒力，但降低了H5N1的抗干扰素能力。
- 龙进学王曲直刘秀梵
- 关键词：重组病毒NS缺失突变
- H5N1亚型禽流感病毒拯救体系的建立被引量：14
- 2006年
- 选择鸡胚高产的鸭源H5N1亚型禽流感病毒A／Duck／Shandong／093／2004株作为骨架病毒，在完成了全基因组序列测定基础上，设计合成的11对引物对病毒的8个基因分11段进行扩增。通过与转录载体PHW2000连接，构建A／SD／04的8个基因的拯救载体，经测序获得序列准确的拯救质粒：241、242、243、244、245、246、247和248。A／SD／04的8质粒与PR8（H1N1）进行不同组合的拯救，获得8个均含A／SD／04HA基因的H5重组流感病毒。鸡胚尿囊液中重组病毒的血凝效价在2^8-2^10，EID50在10^-8.5 - 10^-9之间，MDT在34～46h之间，均与野生A／SD／04（wt A／SD／04）相似。重组病毒对6周龄的SPF鸡的静脉接种指数（IVPI）与wt A／SD／04却有明显的差异，说明不同组合的内部基因影响病毒对鸡的致病力，但不影响病毒的鸡胚致死能力、对鸡胚的感染能力和病毒在鸡胚中的繁殖能力。构建的A／SD／04的8个质粒拯救系统，为H5NI的基因功能研究和新型疫苗开发奠定基础。
- 龙进学吴艳涛张小荣王曲直刘秀梵
- 关键词：H5N1亚型禽流感病毒病毒拯救重组病毒
- 岭南黄鸡γ干扰素的表达纯化及抗病毒活性测定
- 利用RT-PCR技术扩增出岭南黄鸡γ干扰素(IFN-γ)基因,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行序列测定。再将克隆的IFN-γ基因插入到pET-32a质粒中构建原核表达载体,将其转化到Origami(DE3)感受态细...
- 胡思科廖明曹伟胜
- 关键词：基因克隆纯化
- 文献传递
