公共文化服务平台

共 2 条记录，以下是 1-2

全选清除导出

排序方式：

一汉族常染色体显性遗传视网膜色素变性家系视紫红质基因检测分析: 2013年; 背景视紫红质（RHO）基因是常染色体显性遗传视网膜色素变性（adRP）最常见的致病基因，错误折叠的RHO突变型蛋白积聚在内质网从而引起内质网应激（ERS）是其引起视网膜色素变性（RP）的主要发病机制之一。目的检测一汉族adRP家系的致病突变基因，探讨其遗传学基础。方法对参与研究的所有家系成员进行详细的眼科检查。利用新一代测序技术（NGS）对该家系进行189个遗传性视网膜疾病相关基因的目标区域捕获测序，数据经分析滤过，候选突变进行Sanger测序验证和致病性评估。构建视紫红质一增强型绿色荧光蛋白质粒（RHO—pEGFP），包括RHO-pEGFP-N1野生型和RHO-pEGFP-N1突变型质粒，转染人视网膜色素上皮（RPE）细胞系（ARPEl9）和人肾胚293细胞系（HEK293）培养24h，用细胞免疫荧光法观察野生型和突变型RHO—GFP融合蛋白在细胞内的定位；采用荧光定量PCR（Q—PCR）及Westernblot法检测ERS关键因子X盒结合蛋白-1（XBPl）在细胞中的表达。结果该汉族家系共5代，遗传模式符合常染色体显性遗传，家系中患病者眼底特征为RP。NGS数据经分析过滤后获得惟一可能致病突变RHOP．P53R，Sanger测序验证该错义突变在该家系中呈共分离，现存的11例患者均呈杂合子。野生型RHO—GFP融合蛋白呈绿色荧光，分布于呈红色荧光的内质网及细胞膜，而突变型RHO—GFP融合蛋白仅积聚在内质网。与转染RHO-pEGFP—N1野生型的细胞相比，转染RHOp5-pEGFP—N1突变型的HEK293细胞中XBPl表达上调了（1．28±O．09）倍。表达突变型蛋白的HEK293细胞内XBPlmRNA中被特异性地剪切了26个碱基的内含子，转染突变型蛋白的HEK293细胞中XBPl蛋白水平表达明显高于转染野生型、转染空pEGFP—N1质粒细胞及未转染细胞。结论RHO p．P53R是该家系的致病突变基因，该突变型RHO蛋白不能有效地从内质网向细胞膜转运; 陈雪娟高翔赵晨赵堪兴; 关键词：常染色体显性视网膜色素变性视紫红质内质网应激

慢病毒介导的shRNA靶向干扰mTOR基因表达的稳定小鼠成纤维细胞株的建立: 2014年; 背景年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种严重影响视力的眼病。前期的研究发现蛋白激酶／雷帕霉素靶蛋白（Akt／mTOR）通路的激活与AMD的发病机制密切相关，寻找特异性抑制mTOR通路的方法成为治疗AMD的突破点。目的建立稳定抑制mTOR基因表达的小鼠成纤维细胞株，为探讨Akt／mTOR信号通路在AMD发生和进展中的作用提供细胞模型，观察TOR基因沉默对相关蛋白的影响。方法根据鼠源mTORmRNA序列设计并构建3对小发夹RNA（shRNA）干扰序列，分别与质粒GIPZ-GFP＋Puro载体连接，构建重组质粒；将重组质粒与慢病毒包装质粒共同转染小鼠成纤维细胞株NIH／3T3细胞，经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到稳定细胞株，分别应用实时定量PCR和Western blot法检测NIH／3T3细胞中mTOR在基因及蛋白水平的表达变化，筛选出干扰效果最佳的shRNA序列。结果慢病毒感染NIH／3T3细胞3d后，荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白（GFP）的表达，细胞的感染效率均达90％。实时定量PCR和Westernblot检测显示，NIH／3T3细胞中mTOR mRNA和蛋白表达电泳条带清晰、单一；低感染复数（MOI）下，shl组、sh2组和sh3组的NIH／3T3细胞敲低效率分别为31．3％、31．8％和45．3％，而在高MOI下，shl、sh2和sh3的敲低效率分别为47．1％、56．5％和71．6％。Westernblot检测发现，在低或高MOI下shl、sh2和sh3NIH／3T3细胞中mTOR蛋白的表达灰度条带均有不同程度的减弱，显示sh3为最有效的干扰靶点。结论成功构建了mTOR慢病毒表达载体并建立了稳定抑制mTOR基因表达的NIH／3T3细胞株。; 孙潇陈雪娟赵晨赵堪兴; 关键词：慢病毒年龄相关性黄斑变性

全选清除导出

共1页<1>

国家自然科学基金(81170867)

文献类型

领域

主题

机构

作者

传媒

年份

用户反馈

国家自然科学基金(81170867)

文献类型

领域

主题

机构

作者

传媒

年份

用户登录

用户反馈