广东省科技计划工业攻关项目(2011B031200006)
- 作品数：2 被引量：6H指数：1
- 相关作者：杨霞高国全戴智育王征齐炜炜更多>>
- 相关机构：中山大学教育部更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金广东省科技计划工业攻关项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 一种高选择性、高效的牛视网膜微血管内皮细胞培养方法被引量：5
- 2012年
- 目的建立一种高效、可行、特异性高的牛视网膜微血管内皮细胞(BREC)培养方法。方法取新鲜牛眼,分离视网膜并用DMEM进行冲洗、匀浆剪碎,过75μm筛,将滤网上滤渣转移至50ml离心管,用Ⅰ型胶原酶、DNaseⅠ及蛋白酶等多种酶混合液消化20min,人血清中和后,过46μm网筛并冲洗,离心5min,将组织扣在培养皿中,转入15ml离心管,用10%人血清含生长因子ECGS的DMEM培养液培养于25cm2,选择性培养视网膜血管内皮细胞,接种于明胶包被培养瓶中,采用ECGS配合肝素培养液促进内皮细胞生长,观察细胞形状生长特性,并用免疫化学荧光方法进行鉴定。结果选择性培养视网膜微血管内皮细胞成单层、镶嵌铺路石状生长,Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测为阳性纯度均大于95%以上,将细胞种在凝固的基质胶表面,12～18h形成官腔结构。结论本方法过程简单、可靠,培养的内皮细胞纯度高,生长状态良好,稳定传代,为视网膜血管生成疾病研究建立了模型。
- 王征齐炜炜陈少波戴智育陈大伟程锐高国全杨霞
- 关键词：视网膜微血管内皮细胞细胞培养
- 具有抗血管新生活性的K5突变体GST-K5M5基因的构建、表达及纯化被引量：1
- 2013年
- 目的构建可溶性的人纤溶酶原Kringle 5(K5)突变体GST-K5M5基因,并在单位体积的原核系统中获得高表达、高纯度、可水溶的融合GST-K5M5蛋白粉针剂。方法 K5M5突变体基因(模板已经对K5N端5个带负电的酸性氨基酸进行中性氨基酸丝氨酸的中性突变),通过PCR从本实验室保存的pET22b(+)/K5mut5 cDNA模板中扩增得到,再克隆到pGEX-4T-1/BL21(DE3)原核表达系统中。用自动诱导培养系统诱导其表达,提高产量。通过GST树脂亲和层析柱分离,双蒸水透析纯化,再制成冻干粉剂保存。结果该重组GST-K5M5蛋白的分子量为37000Mr,通过SDS-PAGE和Western-blot可以检测到其存在。冻干粉复溶的GST-K5M5呈剂量依赖抑制内皮细胞的增殖。结论在以前的研究基础上设计并用自动诱导培养的方法在大肠杆菌中表达纯化出了GST-K5M5融合蛋白,得到的GST-K5M5蛋白产量高、纯度高、可溶性好、生物学效应强,且方法简便、经济,为工业大规模发酵提供了基本参数。
- 黄莉钧石丁波姚亚超李磊戴智育张婷高国全杨霞
- 关键词：冻干粉
