国家自然科学基金(81072459)
- 作品数：3 被引量：1H指数：1
- 相关作者：江文正龙凤英杜佳妮陈磊郝文丽更多>>
- 相关机构：华东师范大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金教育部“新世纪优秀人才支持计划”上海市青年科技启明星计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 人颗粒酶A全长基因的克隆及原核表达被引量：1
- 2012年
- 目的克隆人颗粒酶A(Granzyme A,GzmA)基因,在大肠杆菌中进行表达,并初步优化表达条件。方法通过RT-PCR扩增人GzmA基因,插入原核表达载体pET24a(+)中,构建重组表达质粒pET24a-GzmA,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并对诱导温度、IPTG浓度、诱导时间和开始诱导时菌液A600值进行优化。结果重组表达质粒pET24a-GzmA经双酶切和测序,证实GzmA基因已正确插入载体中,且序列正确;表达的重组蛋白相对分子质量约29 000,且可与小鼠抗His单抗特异性结合;工程菌的最佳诱导温度为37℃,IPTG浓度、诱导时间和开始诱导时菌液A600值对重组蛋白的表达量影响较小。结论成功克隆了人GzmA基因,并在大肠杆菌中进行了表达。
- 杜佳妮陈磊龙凤英江文正
- 关键词：克隆分子原核细胞
- 人颗粒酶A活性段的表达、纯化及其活性鉴定
- 2015年
- 目的:克隆和表达人颗粒酶A(Granzyme A,Gzm A)基因的活性片段(active Granzyme A,a Gzm A)并进行活性鉴定。方法:以全长人Gzm A基因为模板,PCR扩增a Gzm A基因片段,限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后插入原核表达载体p ET24a(+),将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行分析。重组蛋白用镍层析柱亲和层析进行纯化后,利用BLT底物溶液进行活性鉴定。结果:PCR扩增得到长约700 bp的基因片段。重组质粒p ET24a-a Gzm A经酶切和测序证实a Gzm A基因序列正确插入载体质粒中。SDS-PAGE显示在26 k D处有一特异性蛋白条带。Western blot证实该蛋白可与小鼠抗His单克隆抗体发生特异性结合。利用镍柱亲和层析法可从包涵体中纯化得到纯度较高的重组蛋白,且具有较好的酶活性。结论:成功制备了具有生物学活性的人颗粒酶A重组蛋白。
- 胡雪菲江文正
- 关键词：克隆大肠杆菌活性测定
- 人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定
- 2015年
- 目的利用酵母表达系统制备人LIGHT-Fc融合蛋白。方法利用基因工程方法构建含人LIGHT胞外段基因和人Ig G4 Fc基因的重组质粒p PIC9K-LIGHT-Fc,经SalⅠ线性化后电转化感受态酵母菌GS115,PCR鉴定重组转化子。将阳性重组转化子经甲醇诱导表达后,RT-PCR法检测目的基因的转录水平,SDS-PAGE及Western blot法进行表达产物的鉴定。结果表达质粒p PIC9K-LIGHT-Fc经酶切及测序鉴定,证明构建正确。10个重组子均为Mut+型阳性转化子,经甲醇诱导后可扩增出特异性目的基因片段。表达的重组LIGHT-Fc融合蛋白相对分子质量约45 000,可与鼠抗人LIGHT多克隆抗体发生特异性结合。结论人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中已成功获得了表达,为进一步开展其生物学功能的研究奠定了基础。
- 郝文丽赵勇任华江文正
- 关键词：LIGHT毕赤酵母基因表达
