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猪皮肤源树突状细胞的分离和鉴定被引量：3: 2010年; 分离出不需要体外诱导树突状细胞(DC),为研究病毒与猪DC的关系奠定基础。将刮下的猪皮肤表皮培养过夜,对所分离获得的细胞通过流式细胞术、吉姆萨染色与扫描电镜进行表型与形态鉴定。试验结果表明,通过细胞计数分离到的细胞能达到5×106个细胞,流式细胞术检测细胞CD1a/SWC3a的双阳性细胞率为82.3%;流式细胞术检测CD80/86分子,阳性细胞率为90.2%;通过吉姆萨染色和扫描电镜观察,细胞表面有大量的树突状突起,符合DC的形态特征。通过表型和形态学分析,说明已经成功分离到猪皮肤源DC,为猪病毒性疾病的免疫抑制机理研究奠定基础。; 王振生遇奇李焕荣隋丽华孙英健崔德凤

猪圆环病毒2型感染猪皮肤源树突状细胞炎性反应能力的变化被引量：4: 2009年; 用PCV2 B1株经鼻腔接种40日龄SPF仔猪,于接种后3、7、14 d宰杀,收集皮肤源树突状细胞(DC)。利用实时荧光定量PCR技术对感染仔猪皮肤源DC的IL-10、TNF-α、IFN-αI、L-8、趋化因子受体1(CCR1)、CCR5在mRNA转录水平的变化进行定量分析。结果表明,IFN-α在接种后3 d(3DPI)显著下调(P<0.05),TNF-α、IL-10在7DPI时显著上调(P<0.05);趋化因子IL-8在3、7、14 DPI时均下调,差异接近显著;MCP-1在感染后3、14DPI下调,7DPI均上调,但不显著;MIP-1β在3、7DPI明显上调,14DPI恢复正常;趋化因子受体CCR1、CCR5在3、7和14DPI均上调,且7DPI显著上调(P<0.05)。以上结果表明PCV2在感染早期可抑制DC炎性反应的能力,免疫应答失调,影响了动物机体的细胞和体液免疫功能的发挥。; 王振生聂晓华李焕荣孙英健隋丽华崔德凤; 关键词：猪圆环病毒2型炎性因子趋化因子趋化因子受体

猪血源树突状细胞诱导培养与鉴定被引量：2: 2011年; 为规范DCs诱导培养和鉴定的方法,研究相关病毒致病机制、制定相应的治疗与预防措施奠定技术平台。分离猪外周血单个核细胞(PBMCs),贴壁细胞经一定浓度GM-CSF和IL-4诱导,不同时间观察形态变化,7天后收集所诱导的细胞,经光镜、流式细胞术及激光共聚焦显微镜鉴定其形态、表面标志物CD1a/SWC3a;利用双色流式细胞术检测DCMHC-II分子和CD80/86表达情况。试验结果显示,所诱导的细胞具有典型树突状形态;其表面CD1a/SWC3a双阳性率达到90.1%,MHC-II/CD80/86分子双阳性率达98.3%;激光共聚焦显微镜观察细胞呈集落状,细胞表面CD1a/SWC3a双阳性,表明已经成功诱导出猪血源DC,并获得诱导的标准程序,为研究以DC为靶细胞的猪病毒性疾病免疫致病机理奠定基础。; 聂晓华遇奇李建东李焕荣崔德凤

PCV2感染猪皮肤源树突状细胞内源性抗原加工提呈相关分子转录水平的变化: 2011年; 用猪圆环病毒2型(PCV2)感染40日龄健康长白仔猪,于感染后3、7、14、21、35天宰杀,收集皮肤源树突状细胞(DC)。利用实时荧光定量PCR技术对感染仔猪皮肤源DC内源性抗原加工提呈相关分子(LMP7,UBP,MHC-I,calreticulin)mRNA水平的变化进行定量分析。结果显示,LMP7转录水平在感染后3天显著下调(P<0.05),UBP转录水平始终上调,其中在21天和35天显著上调(P<0.05),MHC-I转录水平在7天显著下调(P<0.05),calreticulin转录水平虽有所上调,但差异不明显。以上结果表明,PCV2在感染早期可抑制猪皮肤源DC内源性抗原加工提呈能力。; 李建东李焕荣聂晓华遇奇崔德凤; 关键词：猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR

PCV2感染猪皮肤源树突状细胞内源性抗原加工提呈相关分子转录水平的变化(英文)被引量：1: 2012年; [目的]该研究旨在探讨PCV2感染猪皮肤源树突状细胞内源性抗原加工提呈相关分子转录水平的变化。[方法]用猪圆环病毒2型(PCV2)感染40日龄健康长白仔猪,于感染后3、7、14、21、35天宰杀,收集皮肤源树突状细胞(DCs)。利用实时荧光定量PCR技术对感染仔猪皮肤源DC内源性抗原加工提呈相关分子(LMP7,UBP,MHC-I,calreticulin)mRNA水平的变化进行定量分析。[结果]LMP7转录水平在感染后3天显著下调(P<0.05),UBP转录水平始终上调,其中在21天和35天显著上调(P<0.05),MHC-I转录水平在7天显著下调(P<0.05),calreticulin转录水平虽有所上调,但差异不明显。[结论]以上结果表明,PCV2在感染早期可抑制猪皮肤源DC内源性抗原加工提呈能力。; 李建东李焕荣聂晓华遇奇崔德凤; 关键词：猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR

疑似PMWS患猪中PCV2的分离及全基因组序列分析被引量：3: 2007年; 将疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）病猪肺脏研磨、过滤除菌后接种无PCVl污染的PKl5细胞，盲传4代，用PCR和免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）检测。同时，利用所合成的PCV2全长的特异性引物进行病毒基因组全长的扩增及克隆、测序与比对分析。结果显示，不同传代细胞中PCV2核酸均为阳性，且PCVl特异引物检测为阴性，表明分离到的PCV2无PCVl污染，将该毒株命名为PCV2B1株。序列分析表明，该病毒基因组全长1767lap，与其他毒株的核苷酸同源性在95．4％～99．8％之间，ORFl的氨基酸的同源性在98．4％～99．7％之间，ORF2的氨基酸的同源性在89．7％～100％，核苷酸和氨基酸的序列与保定株BDlA（DQ910865）的序列最接近。; 王振生李焕荣崔德凤孙英健马乐; 关键词：猪圆环病毒2型仔猪多系统衰竭综合征

猪LFA-1和CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法的建立: 2009年; 【目的】建立猪LFA—1和CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank中核苷酸序列设计猪淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）的特异性引物，经RT-PCR扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定，并对重组质粒标准品和样品cDNA进行检测，构建LFA－1和CTLA-4荧光定量RT-PCR标准曲线。【结果】以1×10^2～1×10^9拷贝／μl不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增后，统计学分析显示标准品浓度的对数与Ct值之间存在良好的线性关系（LFA—1：RSq=0．992；CTLA-4：RSq=0．994）；样品检测显示LFA－1与CTLA－4引物的扩增曲线图和熔解曲线图的特异性。【结论】所构建的质粒标准品具有线性关系好、重复性好、敏感性高等特点，以及其引物在样品检测中的可应用性，为分析猪免疫细胞在感染病毒前后LFA－1和CTLA－4表达的变化以及评估猪体免疫功能，提供必要的技术平台。; 遇奇李焕荣孙英健隋丽华; 关键词：实时荧光定量PCR LFA-1 CTLA-4

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北京市自然科学基金(6062006)