江苏省自然科学基金(BK2004099)
- 作品数：10 被引量：29H指数：3
- 相关作者：侯加法姚静王艳张风荣胡云峰更多>>
- 相关机构：南京农业大学常熟市畜牧兽医站更多>>
- 发文基金：江苏省自然科学基金国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>
- 鸡破骨细胞分化因子(chODF)编码基因克隆与序列分析
- 2007年
- 目的克隆鸡破骨细胞分化因子(chODF)基因,并对其进行序列测定和分析。方法根据GeneBank报道的预测的鸡ODF基因(GeneBank登录号,XM425625)序列,设计引物。从鸡胚额骨分离培养的成骨细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA,用SOE-PCR的方法扩增鸡ODF基因全序列。将获得的预期大小的PCR产物插入pMD18-T克隆载体,转化E.coli感受态细胞,提取质粒,进行双酶切鉴定,对含有目的片段的克隆进行序列测定。结果从成骨细胞中成功地克隆鸡ODF基因片段,其结果与GeneBank上报道的预测序列具有很高的相似性,达到99.3%,与人、小鼠、犬的一致性分别为55.4%、52%和55.7%,提示该基因在进化过程的保守。ODF基因全长1203bp,其阅读框起始于第一个氨基酸,终止于最后一个氨基酸,无信号肽,共编码400个氨基酸。结论ODF作为惟一能够直接诱导破骨细胞分化和功能的细胞因子,对它的深入研究可为探讨骨质疏松等代谢性骨病的发病机制及预防、治疗开辟出广阔的领域。
- 王艳姚静侯加法
- 关键词：基因克隆
- 骨代谢标志物研究进展被引量：12
- 2006年
- 体液中骨代谢生化标志物的检测不仅反映动物体内成骨细胞和破骨细胞的活性,而且为骨代谢变化的评估、监测提供了新的手段。骨代谢标志物包括特异性酶标志物、骨形成代谢产物标志物、骨吸收代谢产物标志物。本文对骨代谢标志物的研究进行了综述。
- 陶庆树周振雷胡丹侯加法
- 关键词：骨代谢
- 白来航笼养蛋鸡胰岛素样生长因子Ⅰ限制性片断多态性与骨质疏松症
- 2007年
- 目的:了解白来航笼养蛋鸡胰岛素样生长因子Ⅰ限制性片断多态性与骨质疏松症的关系。方法:实验于2006-01/04在南京农业大学畜禽骨骼研究实验室完成。随机选取83周龄白来航蛋鸡180羽,应用PCR扩增鸡胰岛素样生长因子Ⅰ启动子上游7kb处基因片断,用PstⅠ限制性内切酶消化产生限制性片断长度多态性,分析胰岛素样生长因子Ⅰ多态性与胫骨、股骨、肱骨骨放射密度及其皮质骨厚度、髓质骨和小梁骨体积、体质量、骨代谢标志物(钙、磷、骨钙素及碱性磷酸酶)、雌二醇等的关系。结果:180羽蛋鸡PP、Pp、pp基因型频率分别为0.0389、0.35、0.611,P、p等位基因频率分别为0.214、0.786。方差分析(ANOVA)显示,pp基因型肱骨骨放射密度及皮质骨厚度显著大于Pp、PP基因型(P<0.05)、pp基因型的胫骨皮质骨厚度极显著大于PP基因型(P<0.01),pp基因型胫骨骨骺骨小梁体积极显著大于Pp、PP基因型(P<0.01)。结论:白来航笼养蛋鸡胰岛素样生长因子Ⅰp等位基因具有一定的骨质指针作用,pp基因型蛋鸡呈现骨质强的优势,提示从分子水平探讨骨质丢失以及对骨质疏松症的基因诊断和抗性基因选育具有一定的意义。
- 王艳张建峰金星芳侯加法
- 关键词：白来航鸡骨质
- 鸡骨保护素在毕赤酵母中的分泌表达及生物学活性测定被引量：1
- 2009年
- 为了在毕赤酵母中表达鸡骨保护素(chOPG),采用DNA重组技术将鸡OPG成熟肽cDNA片段插入毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeoc in平板筛选阳性重组子,经甲醇诱导,实现了OPG在毕赤酵母中的分泌表达。SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达产物存在两种形式,其相对分子质量分别为43000和53000,表达量约为200 mg.L-1,经免疫印迹验证,有较好的抗原性。表达产物经处理后加入到体外培养的鸡胚破骨细胞上,能显著抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性,减少骨吸收陷窝的个数与面积。
- 姚静胡云峰王艳张风荣侯加法
- 关键词：毕赤酵母分泌表达破骨细胞
- rcIGF-Ⅰ对鸡胚额骨成骨细胞骨相关基因mRNA表达的影响被引量：3
- 2006年
- 目的在成功培养、纯化体外鸡胚额骨成骨细胞的基础上,探讨不同剂量重组鸡IGFⅠ(rcIGFⅠ)对成骨细胞骨相关基因(COLⅠ、OPG、IGFⅠR)表达的影响。方法应用酶消化法(0.1%Ⅱ型胶原酶)获取鸡胚额骨成骨细胞群并鉴定。取培养2d的2代成骨细胞,在rcIGFⅠ为0ngml、50ngml、100ngml的浓度中进行培养,采用RTPCR方法检测基因COLⅠ、OPG、IGFⅠR的相对表达情况,并用βactin作为内参照予以矫正。结果rcIGFⅠ可以在转录水平上增加鸡胚额骨成骨细胞骨相关基因的表达,并呈明显的剂量依赖关系。结论IGFⅠ促进成骨细胞的增殖、分化的作用可能是通过增加骨相关基因的表达水平来实现的。
- 张建峰侯加法张皎姚静
- 关键词：成骨细胞基因表达
- 破骨细胞分化因子可诱导鸡骨髓细胞形成破骨样细胞被引量：3
- 2008年
- 研究了鸡破骨细胞分化因子(Chicken osteoclast differentiation factor,chODF)体外诱导鸡骨髓细胞形成破骨样细胞的能力。在无菌条件下取鸡股骨和胫骨,收集骨髓细胞。试验分设A、B、C、D、E、F、G 7组。A组为对照组,不加细胞因子,其他各组为试验组,其中B组仅加chODF,C组只加巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage-colony-stimulating factor,M-CSF),D、E和F组同时加不同浓度的chODF和M-CSF,G组同时加chODF、M-CSF和鸡护骨素(Chicken osteoprotegerin,chOPG)。通过抗酒石酸盐酸性磷酸酶(Tratrate-resistant acid phosphatase,TRAP)、HE、骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色和显微、超微检查,观察和鉴定破骨样细胞(Osteoclast like cell,OLC)的形成。结果表明,chODF可诱导形成典型的OLC,骨吸收陷窝清晰可见,其陷窝面积大,数量多,且TRAP阳性多核细胞的数目与ODF的浓度呈正相关,多组比较其差异显著(P<0.05),但若加入chOPG,则阻断了OLC的形成和骨吸收。本试验建立了一种鸡骨髓细胞诱导破骨样细胞方法,既为体外研究鸡破骨细胞的分化发育和功能调节创造了条件,也为进一步研究OPG/ODF/RANK(NF-κB受体,Receptor activator of NF-κB)在蛋鸡骨质疏松症等骨骼疾病的作用机制提供理论基础。
- 王艳侯加法胡云峰张风荣沈向真
- 关键词：破骨细胞分化因子破骨样细胞骨髓细胞
- 破骨样细胞的诱导培养及其机制被引量：2
- 2006年
- 目的:破骨样细胞是指体外诱导培养的破骨细胞,具有破骨细胞的特征,产生的数量较大,基本能够代替原始破骨细胞应用于研究。主要介绍了破骨细胞分化因子、巨噬细胞集落刺激因子、1,25-羟胆钙化醇、白细胞介素6等诱导培养破骨样细胞和其诱导机制的研究进展。资料来源:应用计算机检索Pubmed数据库1990-01/2005-12有关破骨样细胞诱导培养及机制等相关文章,检索词“osteoclasts,ODF,M-CSF,1,25-DihydroxyvitaminD3,IL-6”,限定文章语言种类为English;同时计算机检索中国期刊全文数据库1994-01/2005-04期间的相关文章,检索词“破骨样细胞,破骨细胞”,限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审。纳入标准:①有关破骨样细胞培养方法的研究。②有关破骨样细胞诱导机制的研究。排除标准:重复研究。资料提炼:共收集到119篇文章,排除重复或类似研究,26篇符合要求被选为参考文献。资料综合:①破骨样细胞的诱导培养:破骨样细胞的细胞来源广泛,诱导剂也不同。②破骨样细胞的诱导机制:破骨细胞分化因子,巨噬细胞集落刺激因子,1,25-羟胆钙化醇,白细胞介素6等各种细胞因子具有其各自的诱导机制,但相互联系,形成复杂的网络结构,最终通过OPG/RANKL/RANK系统发挥作用。结论:破骨样细胞的诱导培养已逐渐成熟,其具体机制得到初步揭示。破骨细胞分化因子、巨噬细胞集落刺激因子、1,25-羟胆钙化醇、白细胞介素6等各种细胞因子虽然最终通过OPG/RANKL/RANK系统来促进破骨细胞的分化,但各因子间复杂的网络作用仍然需要进一步研究。
- 胡云峰邓益锋姚静侯加法
- 关键词：破骨细胞
- 鸡骨保护素(chOPG)的原核表达、纯化及抗体制备被引量：2
- 2008年
- 【目的】骨保护素(OPG)是一种新发现能抑制前体破骨细胞分化及成熟破骨细胞活性的蛋白,本文旨在从体外扩增、表达鸡骨保护素(chOPG)蛋白,并制备其多克隆抗体,为深入研究它的生物学功能奠定基础。【方法】以体外培养的鸡胚成骨细胞中提取的总RNA为模板,利用RT-PCR方法,扩增出chOPG基因,测序后克隆至原核表达载体pET-32a(+),成功构建了原核表达质粒pET-32a(+)-OPG,重组质粒转化Rosetta-gami(DE3)pLysS,经IPTG诱导表达。【结果】表达产物经SDS-PAGE电泳,发现目的蛋白大小约为63kD,占菌体总蛋白的11.9%,Western blotting分析显示,表达的chOPG蛋白具有良好的免疫反应性。用镍离子亲和层析的方法可获得纯化的蛋白,以纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,ELISA结果显示效价达到1﹕10240。Western印迹结果表明,该抗体可以和chOPG酵母表达产物特异性结合。【结论】成功地实现了鸡骨保护素在大肠杆菌中的表达,并获得其多克隆抗体。
- 姚静侯加法王艳张风荣
- 关键词：骨保护素原核表达纯化抗体
