国家科技支撑计划(2008BAI63B07)
- 作品数：22 被引量：44H指数：4
- 相关作者：徐刚吴坚平杨立荣喻晓蔚徐虹更多>>
- 相关机构：浙江大学南京工业大学江南大学更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学化学工程轻工技术与工程理学更多>>
- 重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶的陶瓷膜微滤除菌工艺研究
- 2012年
- 在重组毕赤酵母生产脂肪酶的提取中,应用并优化了陶瓷膜微滤除菌工艺,确定了最佳条件为膜截留分子量500 kDa、膜操作压力0.3MPa、温度20℃、湿菌体含量35%,先对发酵液稀释1.5倍后再进行洗滤。40 L处理量的小试结果显示,在5 h处理时间内,能获得高达92.70%的酶活回收率。560 L处理量的中试放大,酶活回收率为89.91%,耗时5.5 h。在膜的清洗与再生中,采用2%NaClO和2%NaOH在60℃、0.3 MPa膜压力下进行清洗40 min,清水膜通量恢复率为98.14%。陶瓷膜与板框除菌的比较试验发现,两种方法都获得了微生物限量合格的产品和较高的酶活回收率,但陶瓷膜微滤的滤液微生物检出量更低,处理时间较短,动力能耗更低,易与超滤膜耦合提取,废水产生量更少,菌体废渣易于回收,是一种节能减排、清洁环保的新型除菌工艺。
- 谢甲有喻晓蔚徐岩
- 关键词：毕赤酵母脂肪酶陶瓷膜
- 烯酮还原酶基因的克隆与优化表达被引量：6
- 2011年
- 烯酮/酯还原酶可以专一性地还原烯酮/酯中的碳碳双键,并引入两个手性中心,是手性化合物生物催化合成的重要酶类之一;在使用烯酮/酯还原酶进行全细胞手性分子生物催化合成中,其他还原酶的存在常导致副反应的产生.为研究烯酮/酯还原酶的理化性质、底物的专一性、产物的手性特点等,需要经过纯化的烯酮/酯还原酶.为此,根据烯酮还原酶(Enoate reductase,ERs,EC 1.3.1.31)的基因序列设计引物,以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到了目标酶的基因,目的片段全长为1 995 bp,共编码664个氨基酸,相对分子质量为73×103.将烯酮还原酶基因连接到pET-32a(+)上,构建表达质粒pET-32a(+)-ERs,并成功在Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS中表达.在摇床上优化的表达条件为:诱导温度为18℃,诱导起始时菌体D600 nm为0.6～0.8,转速为100 r/min,诱导剂IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导培养时间为12 h,表达的烯酮还原酶大部分以可溶性形式存在于菌体内.
- 吕彤刘扬赵青任杰王敏吴洽庆朱敦明
- 关键词：丙酮丁醇梭菌
- 诱导温度调控华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶的表达及稳定性研究被引量：3
- 2010年
- 比较了7 L发酵罐中不同诱导温度对华根霉前导肽脂肪酶在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达水平和稳定性的影响。通过实验表明在28℃条件下,最大酶活可以达到1412.5 U/mL,是30℃条件下的2.3倍,25℃条件下的1.3倍;而其产率可以达到12811 U/L·h^(-1),比产率达到82.6 U/g_(DCW)·h^(-1)。同时,在实验过程中发现诱导温度对目的蛋白的降解和聚合有重要的影响。通过对蛋白酶活性的测定和还原SDS-PAGE证实随着诱导温度的提高,蛋白酶活性急剧上升,从而导致由前导肽(37 kD)降解为成熟肽(30 kD)的降解作用的加剧。此现象在30℃条件下最为明显,在诱导84 h时前导肽已经全部降解为成熟肽。另外,通过非还原SDS-PAGE和分析表明随着诱导温度的提高也导致了二聚体的含量也逐渐增加。
- 王同春喻晓蔚徐岩
- 关键词：毕赤酵母
- R-2-卤代酸脱卤酶的同源模建及底物对映体选择性研究被引量：2
- 2011年
- 对来自假单胞菌ZJU26中的R-2-卤代酸脱卤酶(DehI-R)进行同源模建,分析其与底物的相互作用,为解析酶的底物对映体选择性提供理论依据。采用Sybyl中的APM模块首次构建并优化了R-2-卤代酸脱卤酶的三维结构,并用Procheck验证结构模型的合理性。使用Surflex-Docking模块将结构模型与底物分别进行对接,分析相互之间的作用。序列比对结果显示,R-2-卤代酸脱卤酶与恶臭假单胞菌PP3中DehI的相似性达23.71%。Deh-R模建后的结构与模板很好的吻合。模型比对分析DehI-R中参与催化的残基,除Asn203外大部分都比较保守。分子对接结果表明,R-2-氯丙酸和S-2-氯丙酸都可以结合到活性位点上,决定其选择性的是位点Asn203,在RS-2-卤代酸脱卤酶所对应位点的残基为Ala,相比之下,Asn具备较大的空间位阻,从而阻止了S-2-氯丙酸的反应。利用Sybyl中的Biopolymer模块对R-2-卤代酸脱卤酶中的Asn203突变成具有不同空间位阻的Ala、Gly和Gln。突变酶与底物对接结果进一步证实了Asn203位点对R-2-卤代酸脱卤酶的底物对映体选择性作用。
- 林春娇杨立荣徐刚吴坚平
- 关键词：同源模建分子对接对映体选择性
- 共价对接法辅助模拟预测脂肪酶的对映体选择性被引量：2
- 2011年
- 以SYBYL软件包中的FlexX对接模块为研究工具,模拟预测了4种脂肪酶对66对手性底物的水解及转酯反应的对映体选择性。模拟过程中,将四面体中间态底物类似物共价对接到脂肪酶的活性位点,以3个必需氢键的形成为筛选条件,去除不符合标准的酶-底物对接构象。对接结果表明:当催化反应的E值较小时(E<100),酶与R/S两种底物的结合自由能差不足以准确预测酶的优先反应构型;而当底物的E≥100,并且主链碳原子数目较少时,该方法对脂肪酶对映体选择性的预测率明显提高,达到81.5%。由于模拟中,酶与绝大多数底物形成了含有3个氢键的反应型构象,符合理论催化模型,同时由于该方法计算速度快,因而该方法可用于高通量模拟预测脂肪酶的潜在底物。
- 袁鹏杨立荣徐刚吴坚平
- 关键词：对映体选择性脂肪酶
- 大黄欧文菌中蔗糖异构酶基因的克隆表达及应用被引量：1
- 2011年
- 以大黄欧文菌(Erwinia rhapontici)NX-5基因组DNA为模板,PCR扩增得到编码蔗糖异构酶(SIase)的基因palⅠ,构建克隆载体pUC18-palⅠ。经测序正确后,将palⅠ亚克隆至表达载体pET-22b(+)上,并在E.coliBL21(DE3)中成功表达相对分子质量约为66 000的可溶性蛋白。通过Ni-NTA柱对表达产物进行纯化,纯酶的比活为40 U/mg。转化条件研究表明:重组菌能够高效转化质量分数为50%的蔗糖溶液,转化液中异麦芽酮糖得率为85%。
- 李莎任贲林璐徐虹蔡恒
- 关键词：克隆表达
- 核苷酸锆固定化脂肪酶的制备及其催化性能被引量：1
- 2011年
- 开发了以核苷酸锆纳米颗粒为载体固定化脂肪酶的方法,考察了固定化时间、缓冲液pH值及浓度和酶载量等因素对固定化酶在有机相中催化烯丙醇酮酯交换反应性能的影响.结果表明,一元尿苷酸锆(粒径30～50nm)是较佳的载体,在磷酸缓冲液pH=8.0和浓度为0.03mol/L时,酶与载体质量比为4,固定化6h制得的固定化酶效果最佳.固定化酶的活力回收率是游离酶的6.8倍;对映体选择率(E=200)明显高于游离酶(E=86).以一元尿苷酸锆作为载体制得的固定化酶的操作稳定性显著提高,重复利用20批次后残余活力为58.7%,而游离酶仅为4%.
- 陶维红杨立荣徐刚乔元彪吴坚平
- 关键词：固定化酯交换反应
- 固定化N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶拆分消旋蛋氨酸
- 2010年
- 基因工程菌BL21/pET22b-argE可高效表达N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶。将含酶细胞包埋于海藻酸钙凝胶中制成固定化细胞酶,用于消旋蛋氨酸的拆分,并将其拆分能力、拆分速度及操作稳定性与游离细胞酶相比较。结果表明:单批次转化固定化细胞酶的拆分能力和游离细胞酶相近,拆分速度较慢;但多批次转化的操作稳定性显著高于游离细胞酶。重复利用8次后的固定化细胞酶仍保有95%以上的酶活力,重复利用5次后的游离细胞酶活已降至20%左右。每克湿菌泥在游离和固定化条件下重复拆分产L-蛋氨酸的量分别为74.16mmol和241.93mmol。酶拆分液中的L-蛋氨酸经重结晶后光学纯度为98.3%。固定化细胞酶比游离细胞酶更具有工业化应用的潜质。
- 金圣芳李环韦萍
- 关键词：拆分
- Ca^(2+)对枯草芽孢杆菌γ-谷氨酰转肽酶活性和热稳定性的影响被引量：1
- 2011年
- γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)可将γ-谷氨酰基从酰基供体催化转移至相应的受体上,形成新的γ-谷氨酰基化合物。今针对GGT稳定性差的缺陷,采用添加Ca2+的方法对其进行稳定化。研究了Ca2+对枯草芽孢杆菌GGT活性及热稳定性的影响。以4 mmol·L-1 CaCl2于37℃下处理30 min后,GGT的热稳定性得到了显著改善,且随温度升高Ca2+处理的效果更明显;测定了Ca2+处理后GGT酰基化反应动力学常数Km、Vmax和反应活化能Ea,其值分别为0.23 mmol·L-1,0.015 mmol·L-1·min-1和10.50 kJ·mol-1。与未经Ca2+处理时相比,酰基化反应米氏常数和反应活化能显著降低;GGT的失活反应活化能Ed为60.47 kJ·mol-1,与未加Ca2+时(50.42 kJ·mol-1)相比明显提高。表明Ca2+能提高GGT的活性和热稳定性,有效缓解酶的受热失活。
- 宋希文肖彦羚周治姚忠徐虹韦萍
- 关键词：Γ-谷氨酰转肽酶热稳定性CA2+反应动力学活化能
- 海栖热袍菌极耐高温木聚糖酶基因xynB_(64)在大肠杆菌中的融合表达被引量：3
- 2011年
- 来源于极端嗜热菌海栖热袍菌(Thermotoga maritima MSB8)的木聚糖酶B具有极高的热稳定性,在饲料、造纸、能源和食品医药行业具有巨大应用潜力。携带酶基因xynB64的pET28a(+)重组载体在宿主大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,重组酶活力较低。更换宿主为携带稀有tRNA基因的大肠杆菌:BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL和Rosetta(DE3)后,酶活力分别提高了197%和277%,但是后者中的表达会形成部分包涵体。宿主菌为大肠杆菌Rosetta(DE3),更换载体为4种融合表达载体pET32a(+)、pET42a(+)、pET43.1a(+)和pMAL-c2X进行表达,重组酶分别融合了Trx、GST、Nus和MBP标签。其中Rosetta(DE3)/pMAL-c2X-xynB64表达酶活力最高,相当于Rosetta(DE3)/pET28a-xynB64表达酶的88%,而且目的酶表达量占全细胞蛋白的40%,几乎不形成包涵体。
- 孙涛申宁白羽李文豪韦萍
- 关键词：稀有密码子融合标签翻译起始区
