重庆市自然科学基金(2007BB5056)
- 作品数：4 被引量：12H指数：3
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- 相关机构：第三军医大学新桥医院更多>>
- 发文基金：重庆市自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 兔椎间盘髓核细胞体外生物学特性的实验研究被引量：3
- 2008年
- 目的对兔椎间盘髓核细胞进行体外培养,观察细胞的形态、表型及超微结构改变,研究其体外生物学特性。方法取2周龄健康新西兰白兔椎间盘髓核组织,在含有15%灭活FBS的DMEM/F12培养液中培养,倒置相差显微镜下观察原代和传代细胞形态。分别在取材后、原代、第1代、第2代细胞培养期间,进行髓核细胞活力测定;爬片培养后进行甲苯胺蓝、HE、聚集蛋白聚糖番红O、Ⅰ型及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察;MTT法绘制髓核细胞生长曲线,并行原代及第2代细胞透射电镜观察,对体外细胞的生物学特性进行研究。结果倒置相差显微镜见原代髓核细胞呈类圆形,折光性较强;5d开始有细胞贴壁,细胞呈多角形或短梭形;6～8d细胞生长进入指数生长期;约17d时,细胞长满瓶壁,可进行传代;随传代次数增加,细胞形态逐渐由多角形、短梭形向长梭形改变。髓核细胞活力测定在刚分离完成后细胞活力为95%～97%,原代培养期间为98%～100%,第1代培养期间仍能维持为100%,第2代细胞活力下降较为明显,为75%～80%。髓核细胞甲苯胺蓝染色呈强阳性;HE染色见细胞核、细胞质着色明显。第1代髓核细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阴性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,聚集蛋白聚糖番红O染色呈阳性;第2代细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈弱阳性,聚集蛋白多糖番红O染色着色较浅。MTT生长曲线与体外细胞培养时生长过程相符。透射电镜显示原代髓核细胞内线粒体少,胞质内有大量糖原颗粒,随传代次数增加,糖原颗粒减少,线粒体数量增多,细胞器开始肿胀。结论明确了兔髓核细胞体外生物学特性变迁,为组织工程髓核的种子细胞研究提供了实验依据。
- 刘杰王建周跃
- 关键词：髓核细胞体外培养生物学特性
- BMSCs-壳聚糖凝胶复合体移植治疗椎间盘退变的实验研究被引量：4
- 2009年
- 目的探讨兔BMSCs-壳聚糖凝胶复合体移植治疗椎间盘髓核缺损退变的效果,为临床应用提供实验依据。方法6只健康1月龄新西兰白兔,雌雄不限,体重1.0～1.5 kg。取骨髓2 mL,分离培养BMSCs。取第3代BMSCs,5-BrdU活细胞示踪剂标记,与壳聚糖凝胶混匀,制备BMSCs-壳聚糖凝胶复合体。将6只动物建立兔椎间盘髓核缺损退变模型,并随机分为3组(n=2):正常对照组仅分离暴露椎间盘,不作任何处理;移植治疗组将30μL自体BMSCs-壳聚糖凝胶复合体注射入缺损椎间盘中心;缺损退变组仅注射入0.01 mol/L PBS液30μL。移植后4周处死动物,取出移植修复的椎间盘,行细胞5-BrdU标记检测、HE、aggrecan番红O染色及ColⅡ免疫组织化学染色;ColⅡ免疫组织化学染色切片行灰度值测定。结果细胞标记检测发现,自体BMSCs移植后继续存活并增殖,形成细胞克隆。正常对照组及移植组椎间盘HE染色示椎间盘结构清晰,髓核组织及外周纤维环分界清晰,细胞核及细胞浆染色明显;缺损退变组示椎间盘结构紊乱,髓核组织和外周纤维化分界不清。aggrecan番红O染色示正常对照组及移植治疗组椎间盘染色明显,椎间盘结构清晰;缺损退变组椎间盘结构紊乱,髓核组织和外周纤维化分界不清。ColⅡ免疫组织化学染色示正常对照组以中央髓核组织染色为主,呈黄褐色阳性反应,椎间盘结构清晰;移植治疗组中央髓核组织呈阳性反应,细胞间质可见明显黄褐色,大体结构仍保持完整;缺损退变组染色较前两组浅,且结构不清。3组ColⅡ免疫组织化学染色切片行灰度值测定,正常对照组为223.84±3.93,与移植治疗组(221.03±3.53)比较差异无统计学意义(P>0.05),但两组与缺损退变组(172.50±3.13)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论兔BMSCs-壳聚糖凝胶复合体可修复椎间盘缺损退变,为临床应用可注射式组织工程髓核移植治疗椎间盘退变奠定实验基础。
- 刘杰王建周跃
- 关键词：BMSCS椎间盘退变
- 不同种子细胞复合壳聚糖水凝胶构建可注射组织工程髓核的比较研究被引量：2
- 2010年
- 目的比较兔髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)和BMSCs在温敏性壳聚糖水凝胶支架中的生长及细胞外基质合成,筛选用于构建可注射组织工程髓核的种子细胞。方法取3周龄新西兰乳兔,体重150～200g,雌雄不限,分离培养兔NPCs;取1月龄新西兰白兔,体重1.0～1.5kg,雌雄不限,穿刺抽取骨髓分离培养BMSCs。以壳聚糖、β甘油磷酸钠水溶液和羟乙基纤维素溶液为原料制备壳聚糖水凝胶支架。取第2代NPCs和第3代BMSCs分别与壳聚糖水凝胶混匀,构建可注射组织工程髓核。复合培养2d,观察NPCs和BMSCs在壳聚糖水凝胶中的存活情况;复合培养1周,扫描电镜观察两种细胞在支架中的生长分布;复合培养3周,行组织学、免疫组织化学检查,并用RT-PCR检测组织工程髓核中聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA的表达。结果温敏性壳聚糖水凝胶室温呈液态,37℃放置15min发生交联反应成为半固态凝胶。吖啶橙/碘化丙啶染色示壳聚糖水凝胶中多数NPCs和BMSCs存活,少数死亡,细胞存活率均>90%。扫描电镜示NPCs和BMSCs分布于网状支架中,细胞表面有分泌的细胞外基质。HE染色、番红O染色及免疫组织化学染色显示细胞具有分泌细胞外基质的功能。RT-PCR检测示NPCs在壳聚糖水凝胶支架中复合培养3周,Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达量分别为0.564±0.071、0.725±0.046,BMSCs复合培养物分别为0.713±0.058、0.852±0.076,两种细胞比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论温敏性壳聚糖水凝胶具有良好的细胞相容性,与NPCs比较,BMSCs复合壳聚糖水凝胶培养保持了更好的形态、增殖及细胞外基质合成功能。
- 王建刘杰田华科李长青周跃
- 关键词：髓核细胞BMSCS
- 体外构建可注射式组织工程髓核的初步研究被引量：3
- 2009年
- 目的研究兔髓核细胞在温敏性壳聚糖水凝胶支架上的生长情况,探讨其构建可注射式组织工程髓核的可行性。方法取3周龄新西兰乳兔,体重150～200 g,雌雄不限,分离培养兔髓核细胞。以壳聚糖、β-甘油磷酸钠水溶液和羟乙基纤维素溶液为原料制备壳聚糖水凝胶支架,并行物理性状及大体观察。将支架与兔髓核细胞复合构建组织工程髓核。复合培养2 d,观察髓核细胞在壳聚糖水凝胶中的存活情况;复合培养1周,扫描电镜观察髓核细胞在支架上的生长情况;复合培养3周后,行组织学、免疫组织化学检测,并用RT-PCR检测其分泌的聚集蛋白聚糖、ColⅡmRNA表达。结果制备的温敏性壳聚糖水凝胶室温呈液态,37℃放置15 min可发生交联反应成为固态凝胶。吖啶橙/碘化丙啶染色示壳聚糖水凝胶中大多数髓核细胞存活,少数死亡,细胞存活率>90%;扫描电镜示髓核细胞分布于网状支架中,细胞表面有分泌的ECM;HE、甲苯胺蓝、番红O染色及免疫组织化学染色结果显示软骨细胞具有分泌ECM的功能;RT-PCR检测示髓核细胞在壳聚糖水凝胶支架中立体培养3周后ColⅡ、聚集蛋白聚糖mRNA分别为0.631±0.064、0.832±0.052,较单纯培养(0.528±0.039、0.773±0.046)分泌基质的能力更强,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论温敏性壳聚糖水凝胶材料具有良好的细胞相容性,髓核细胞与其复合培养后可保持正常形态及分泌功能,有望成为髓核细胞载体构建组织工程髓核。
- 田华科王建陈超刘杰周跃
