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Interactions among SARS-CoV accessory proteins revealed by bimolecular fluorescence complementation assay: 2015年; The accessory proteins(3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b, 9b and ORF14), predicted unknown proteins(PUPs) encoded by the genes, are considered to be unique to the severe acute respiratory syndrome coronavirus(SARS-Co V) genome. These proteins play important roles in various biological processes mediated by interactions with their partners. However, very little is known about the interactions among these accessory proteins. Here, a EYFP(enhanced yellow fluorescent protein) bimolecular fluorescence complementation(BiFC) assay was used to detect the interactions among accessory proteins. 33 out of 81 interactions were identified by BiFC, much more than that identified by the yeast two-hybrid(Y2H)system. This is the first report describing direct visualization of interactions among accessory proteins of SARS-CoV. These findings attest to the general applicability of the BiFC system for the verification of protein-protein interactions.; Jianqiang KongYanwei ShiZhifang WangYiting Pan; 关键词：SARS-COV

红色荧光蛋白在酿酒酵母中的表达特性研究: 2012年; 目的研究红色荧光蛋白编码基因Dsred在酿酒酵母菌中的快速克隆与表达。方法根据已发表基因序列设计引物,采用连续重叠PCR方法快速克隆获得全长Dsred基因,将其与pMD-18T载体连接后进行测序鉴定。通过In-fusion方法将鉴定正确的pMD-Dsred重组载体与酿酒酵母表达载体pYeDP60进行连接,测序后利用LiAc方法将鉴定正确的pYeDP60-Dsred重组表达载体转化至酿酒酵母菌W303-1B中,PCR扩增筛选阳性克隆,获得的W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌经诱导培养后进行SDS-PAGE电泳分析和绿光激发荧光成像检测。将工程菌分别接种至YPD、YPG、SCG和SCD培养基,培养48、72、96、120和144h后分别测定吸光度(A600)值。取诱导表达后的工程菌(菌液组)进行离心(菌体组)、离心后加甘油(高渗组)处理,分别置于–70、–20、4、28和37℃条件培养,荧光显微镜观察其表达特性。结果连续重叠PCR扩增和测序鉴定结果表明,扩增获得的Dsred基因长为678bp,其序列与已发表的基因序列完全一致;Dsred基因已成功插入pYeDP60-Dsred重组表达载体,且受酵母诱导型启动子GAL10-CYC1调控表达。PCR扩增筛选和SDS-PAGE分析显示,pYeDP60-Dsred重组表达载体已成功导入酿酒酵母菌中,诱导表达产物相对分子质量与预期相符,且诱导后工程菌可在绿光激发下发出红色荧光。4种培养基内工程菌的菌体生长情况无明显差别,重组Dsred红色荧光蛋白表达不会抑制酿酒酵母菌体生长。荧光显微镜观察显示,工程菌经不同处理后,高渗组红色荧光蛋白成熟时间最短,菌液组时间最长;红色荧光蛋白在37℃条件下培养时成熟最早,但降解速度较快。结论成功构建了pYeDP60-Dsred重组酿酒酵母表达载体,实现了Dsred基因在酿酒酵母菌体内的异源表达。红色荧光蛋白表达对酿酒酵母菌体生长无明显影响,且离心保留菌体和加入甘油等缺水高渗处理都有利于红色荧光蛋白的成熟。; 史彦薇王志芳王伟安建梅孔建强; 关键词：发光蛋白质类

一种用于筛选启动子元件库的酵母检测载体的构建及初步应用被引量：2: 2013年; 天然药物合成生物学技术是一种采用多基因控制的方式,实现天然产物代谢途径在异源底盘细胞中的重构。启动子是调控基因表达的一种顺式元件,对多基因控制的代谢途径的平衡起着重要的作用。为了筛选获得性能优越的启动子用于多基因控制的代谢途径,一个基于红色荧光蛋白的酵母检测质粒被构建。首先,根据已经发表的红色荧光蛋白基因,设计并合成了一系列引物,通过连续重叠PCR的方法合成了全长红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer,并将该红色荧光蛋白基因导入酿酒酵母,SDS-PAGE、Western blot以及荧光显微镜观察都表明该红色荧光蛋白基因在酿酒酵母中获得了表达。然后,将具备功能的DsRed-Monomer基因与酿酒酵母表达载体pGBT9进行重组,获得能进行启动子文库筛选的启动子检测质粒pGBT9Red。为了检测该质粒的效能,通过PCR从酿酒酵母基因组中克隆得到了6种启动子(包括4种诱导型启动子和2种组成型启动子),并将6种启动子分别克隆到pGBT9Red中,置于红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer上游,通过荧光成像确定启动子对红色荧光蛋白基因表达的调控效率。结果表明,6种启动子(GAL1、GAL2、GAL7、GAL10、TEF2和PGK1)在酿酒酵母中均能调控DsRed-Monomer的表达。该检测质粒的成功构建为进一步进行启动子活性分析和启动子元件文库筛选奠定基础。; 王志芳王志标李丽娜安建梅王伟程克棣孔建强; 关键词：启动子酿酒酵母

甲型流感病毒NS1蛋白与人CPSF30结合拮抗剂酵母荧光筛选模型的构建与初步应用: 甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1是个多功能蛋白,能和人CPSF30蛋白结合,抑制宿主细胞抗病毒蛋白pre-mRNA的加工,破坏宿主细胞抗病毒防线。本文采用双分子荧光互补技术针对NS1和CPSF30的相互作用,构建了一...; 孔建强史彦薇王志芳王伟程克棣; 关键词：甲型流感病毒实验药理

双分子荧光互补技术的应用与展望被引量：3: 2013年; 双分子荧光互补技术是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术。该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用,彼此靠近,重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子,从而产生荧光。BiFC方法简单直观,具有可视性的特点,对温度敏感,荧光片段种类较多,被广泛地应用到不同的细胞中,既可以检测蛋白之间的相互作用,也可以定位蛋白质相互作用的位点。此外,BiFC还能在蛋白构型的确定以及RNA的检测方面发挥作用。经过若干年的发展,双色荧光互补技术已经发展成包括多色荧光互补技术,BiFC和FRET联用技术以及BiFC和YTH联用技术在内的多种技术,拓宽了BiFC的应用。; 史彦薇孔建强安建梅; 关键词：荧光蛋白蛋白质相互作用

含DsRed类似生色团的红色荧光蛋白的发展及应用被引量：4: 2013年; 自从绿色荧光蛋白(GFP)被发现以来,荧光蛋白在生物医学领域已经成为一种重要的荧光成像工具.随着红色荧光蛋白DsRed的出现,各种优化的DsRed突变体和远红荧光蛋白也不断涌现.其中荧光蛋白生色团的形成机制对改建更优的荧光蛋白变种影响很大,对于红色荧光蛋白而言,大多数的红色荧光蛋白的生色团类型为DsRed类似生色团,在此基础上又出现了Far-redDsRed类似生色团.目前,含DsRed类似生色团的荧光蛋白主要有单体红色荧光蛋白、光转换荧光蛋白、斯托克斯红移蛋白、荧光计时器等.这些优化的荧光蛋白作为分子探针可以实现对活细胞、细胞器或胞内分子的时空标记和追踪,已经在生物工程学、细胞生物学、基础医学领域得到广泛应用.本文综述了含DsRed类似生色团的荧光蛋白的研究进展及其应用,以及由此发展起来的远红荧光蛋白在活体显微成像技术中的应用,并展望了荧光探针技术研究的新方向.; 王志芳安建梅孔建强

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国家自然科学基金(81072673)

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