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国家自然科学基金(30801074)
作品数:
3
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邹望远
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宋宗斌
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慢病毒介导的RNA干扰对大鼠神经元PKCγ mRNA及蛋白表达的影响
2010年
目的 探讨慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)对大鼠神经元PKCymRNA及蛋白表达的影响.方法 孕16d的SD大鼠,原代培养大鼠胚胎皮层神经元,随机分为3组,每组6孔,对照组(C组):不行任何处理;阴性对照组(NC组):每孔加入阴性对照慢病毒3×10^5个;RNAi组:每孔中加入编码PKCγ shRNA的慢病毒载体(LV-PKCγ shRNA)颗粒3×10^5个.5 d后采用RT-PCR和Western blot法检测PKCγ mRNA和蛋白的表达水平,并计算干扰效率.结果 与C组比较,RNAi组大鼠神经元PKCγ mRNA及其蛋白表达水平均降低(P〈0.05),NC组上述指标差异无统计学意义(P〉0.05).基因干扰效率99.3%,蛋白干扰效率85.2%.结论 慢病毒介导的RNAi可有效地下调大鼠原代神经元PKCγ基因及其蛋白的表达.
邹望远
郭曲练
宋宗斌
刘畅
潘韫丹
关键词:
RNA干扰
慢病毒属
神经元
神经病理性痛大鼠脊髓蛋白质组图谱的建立
被引量:1
2008年
目的建立神经病理性痛大鼠脊髓蛋白质组图谱。方法成年雄性SD大鼠16只,体重260~320g,随机分为2组(n=8):假手术组(S组)和神经病理性痛组(NP组)。采用慢性缩窄性坐骨神经损伤法(CCI)制备大鼠神经病理性痛模型,S组仅暴露坐骨神经,不结扎。分别于CCI前1d(基础状态)及CCI后5、7d测定机械痛阈和热痛阈;于CCI后7d痛阈测定结束后取腰段脊髓组织,每组大鼠的脊髓组织混合后提取总蛋白质,测定脊髓组织蛋白质含量。以固相pH值梯度等电聚焦(IEF)为第一向,SDS—PAGE垂直电泳为第二向进行双向凝胶电泳(2-DE),制备脊髓蛋白质2-DE图谱,应用图像分析软件分析2-DE图谱,并观察其差异表达情况。结果与S组比较,NP组CCI后机械痛闽和热痛阈降低(P〈0.05);两组大鼠脊髓组织总蛋白质经双向凝胶电泳分离,银染显色后得到分辨率高、重复性好的2-DE图谱,蛋白质点主要分布在pH3~10,相对分子质量为8~120的区域;NP组差异表达的蛋白质有23个,其中16个蛋白质表达上调,7个蛋白质表达下调(P〈0.05);表达上调幅度最大的为SSP2203蛋白,表达下调幅度最大的为SSP1807蛋白(P〈0.05)。结论本研究成功地建立了神经病理性痛大鼠脊髓蛋白质组的图谱。
邹望远
李茂玉
郭曲练
宋宗斌
张重
赵媛
贺正华
关键词:
神经痛
脊髓
蛋白质组学
PKCγ基因RNAi慢病毒载体的构建
被引量:1
2010年
目的构建蛋白激酶CT(PKCT)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法针对已经筛选确定的PKCγ基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸序列(Oligo)DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切后的pGCSIL-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接,转化DH5a大肠杆菌,挑选重组阳性克隆行PCR鉴定和DNA测序。用pGCSIL-GFP、pHelper 1.0和pHelper2.0三质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,逐孔稀释滴度法测定病毒滴度。结果PCR鉴定结果显示,以经双酶切后未插入片断的pGCSIDGFP空载体(PCR产物为306bp)为对照,重组细菌克隆的PCR产物为343bp(插入片段为37bp),鉴定结果与预期相符。测序结果显示,合成的PKC7基因shRNA寡核苷酸链序列插入正确。包装慢病毒,浓缩慢病毒悬液的滴度为1×10^9TU/ml。结论成功构建了PKCT基因shRNA慢病毒载体。
邹望远
郭曲练
宋宗斌
罗和国
张重
刘畅
关键词:
RNA干扰
蛋白激酶C
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