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3-羟基丙酸分批发酵过程中的pH控制策略研究被引量：3: 2013年; 本文利用重组大肠杆菌以甘油为底物发酵合成3-羟基丙酸,考察了不同pH对3-羟基丙酸产量及茵体生长的影响,发现在pH 6.5条件下,细胞比生长速率达到最大值,延迟期也相对较短;而pH 7.0有利于3-羟基丙酸的合成,控制pH 7.0可以使3-羟基丙酸产量达到7.39 g/L。基于不同pH条件下对细胞比生长速率和3-羟基丙酸比生成速率的分析,提出3-羟基丙酸分批发酵过程中的pH控制策略,即在发酵过程前5 h将pH控制在6.5,5 h^15 h控制pH为7.0,此时有利于细胞生长;而后在15 h^25 h控制pH为7.5,25 h后控制pH为7.0,从而使细胞具有较高的3-羟基丙酸比合成速率。在此控制策略下经过34 h发酵3-羟基丙酸的终产量达到8.76 g/L,比pH 7.0条件下的3-羟基丙酸产量提高了18.54%。; 牛坤张志伟柳志强郑裕国; 关键词：3-羟基丙酸甘油重组大肠杆菌分批发酵

静息细胞转化生产3-羟基丙酸的条件优化被引量：2: 2014年; 本文研究了静息细胞生物转化生产3-羟基丙酸的反应体系。考察了以甘油为底物,利用静息细胞转化生产3-羟基丙酸的相关因素,确定了最佳的转化条件:细胞浓度20g/L,甘油浓度20g/L,辅酶VB_(12)浓度10 mg/L,NAD^+浓度0.15 mmol/L,温度35℃,反应体系为0.05 mol/L pH 7.0Tris-HCl缓冲液。在上述条件下反应6h后,3-羟基丙酸的产量达到为3.17g/L,底物转化率为28.33%。由上述结果可知,采用静息细胞转化法为3-HP的生物合成提供了一种可能的方法。; 牛坤孔定国柳志强郑裕国; 关键词：3-羟基丙酸甘油

α-酮戊二酸半醛脱氢酶的定点突变及酶学性质变化被引量：2: 2017年; 3-HP是一种性质优良的化学中间体,以甘油为底物生产3-HP的研究备受青睐,而限制3-HP产量的主要原因是Ald H活力过低。对源于Azospirillam brasilense的α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSADH)基因同源建模和结构分析,采用定点突变方法得到高活力KGSADH,将突变酶表达纯化,探讨酶学性质的变化。结果表明,TU-KGSADH(E120D/P219A)酶活力达6.03U/mg,比原始酶比酶活提高了322%,最适温度由35℃降低为30℃,且热稳定性降低,最适p H为8.0,在p H 6.0-8.0条件下酶活力有所提高。Zn^(2+)对KGSADH的酶活有较强的抑制作用,而Co^(2+)、Fe^(3+)、Fe^(2+)对KGSADH的酶活有较大的激活作用。在酶的动力学方面,TU-KGSADH对乙醛的K_m由7.58降为6.28 mmol/L,V_(max)由10.6提高为12.3 U/mg。对酶学性质改变的因素分析发现,120位突变与最适p H下降和p H稳定性向酸性偏移有关,219位突变可能是最适温度和热稳定性降低的原因,为醛脱氢酶进一步定向改造提供参考。; 秦海彬熊涛张博牛坤; 关键词：定点突变表达纯化酶学性质

甘油发酵生产3-羟基丙酸的代谢改造工程菌研究进展被引量：3: 2015年; 3-羟基丙酸是一种重要的平台化合物,可以用来合成许多重要的化工中间体及工业化工产品,被美国能源部列为当前最具潜力的12种化工产品之一。文中就近年来以大肠杆菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)作为宿主进行代谢改造合成3-羟基丙酸的相关研究进行了总结,介绍了当前以甘油为底物发酵合成3-羟基丙酸的主要研究成果,并针对目前存在的问题加以展望,旨在为3-羟基丙酸的工业化生产提供参考。; 牛坤秦海彬柳志强郑裕国; 关键词：甘油 3-羟基丙酸甘油脱水酶醛脱氢酶

琥珀酸半醛脱氢酶GabD4的表达、纯化及酶学性质分析被引量：1: 2016年; 人工合成琥珀酸半醛脱氢酶Gab D4基因,经蛋白表达和纯化,对其酶学性质进行研究。结果表明,Gab D4的最适反应温度为37℃;最适p H为7.5（磷酸盐缓冲液）或9.0（甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）;金属离子中,Cu2＋对Gab D4酶活力的影响较大;Gab D4对3~5个碳的醛底物具有更高的催化效率;以乙醛为底物,计算得到米氏常数（Km）、最大反应速率（Vmax）分别为6.86 mmol/L和20.6μmol/（min·mg protein）。该结果为深入了解Gab D4的酶学性质提供参考。; 贾东旭刘东郑裕国; 关键词：醛脱氢酶分离纯化酶学性质

代谢工程改造Escherichia coli生产3-羟基丙酸: 2017年; 以提高3-羟基丙酸的产量为目标,对实验室构建的基因工程大肠杆菌进行改造,敲除形成副产物1,3-丙二醇的主要酶基因——乙醛脱氢酶基因yqh D,得到E.coli W3110Δyqh D(p CDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/p ACYCDuet-tac-dha B1-4),该工程菌摇瓶发酵产量达到2.53 g/L,相比未敲除yqh D基因的菌株,产量提高了5.8倍。另外,敲除了甘油代谢途径中的抑制因子glpR基因,得到E.coli W3110ΔglpR(p CDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh/p ACYCDuet-tac-dha B1-4),该工程菌摇瓶发酵产量达到2.86 g/L,相比未敲除glpR基因的菌株,产量提高了6.7倍。后经5 L罐发酵培养后,3-羟基丙酸的产量提升到15.4 g/L。该实验为进一步利用大肠杆菌工程菌发酵生产3-羟基丙酸提供了研究基础。; 程秀丽秦海彬熊涛牛坤; 关键词：3-羟基丙酸基因敲除重组大肠杆菌

不同醛脱氢酶对重组克雷伯氏菌生产3-羟基丙酸的影响: 2017年; PCR扩增Cupriavidus necator Gab D4和Azospirillum brasilense KGSADH醛脱氢酶基因,分别与经改造获得卡那霉素抗性的p UC19质粒(p UC19Kan)连接,再转化至Klebsiella pneumoniae DSM2026,获得重组菌KpKan/KGSADH和KpKan/Gab D4。经摇瓶发酵,KpKan/KGSADH和KpKan/Gab D4的最高3-羟基丙酸(3-HP)产量分别为3.66与2.56 g/L,与未导入醛脱氢酶的K.pneumoniae对照菌相比,分别提高了352%与216%。对其他产物的研究表明,2株重组菌的1,3-丙二醇(1,3-PDO)的产量低于对照菌,而2,3-丁二醇(2,3-BD)和乙酸产量高于对照菌。该研究首次将C.necator Gab D4醛脱氢酶基因导入K.pneumoniae,并对比了KpKan/KGSADH与KpKan/Gab D4的3-HP产量,实验中确定的性能优良的发酵菌株为继续提高3-HP产量提供了帮助。; 贾东旭陈铁男周佳锋牛坤秦海彬金利群; 关键词：克雷伯氏菌甘油醛脱氢酶 3-羟基丙酸

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国家自然科学基金(21306173)