安徽省自然科学基金(050430603)
- 作品数：9 被引量：10H指数：2
- 相关作者：李柏青薛祝平葛晓松汪洪涛唐洁更多>>
- 相关机构：蚌埠医学院安徽医科大学蚌埠医学院第二附属医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- GST-颗粒溶解素融合蛋白的纯化及其抗菌活性分析被引量：1
- 2007年
- 目的:纯化大肠埃希菌表达的GST-颗粒溶解素融合蛋白,并分析其体外抗菌活性。方法:将IPTG诱导处理后的细菌破碎,分离含有可溶性GST-颗粒溶解素融合蛋白的细菌裂解液,并通过GSH-琼脂糖珠亲和层析柱纯化。同时采用MTT法分析该纯化蛋白的抗菌活性。结果:GST-颗粒溶解素融合蛋白能以可溶性形式在大肠埃希菌中表达,采用亲和层析法可获得分子量为44kDa的单一蛋白条带。经抗菌活性分析,表明纯化产物对金黄色葡萄球菌和甲型溶血性链球菌具有显著抑制作用,而对伤寒沙门菌和大肠埃希菌BL21的抗菌活性不明显。结论:成功纯化GST-颗粒溶解素融合蛋白,该蛋白对革兰阳性菌具有高效抗菌活性。
- 闵宏林沈继龙陈勇李柏青
- 关键词：大肠埃希菌纯化抗菌作用
- 转录因子t-bet在人CD8^+T细胞和γδT细胞干扰素-γ产生中的作用被引量：1
- 2008年
- 目的:探讨转录因子t-bet对人CD8+T细胞和γδT细胞干扰素-γ(IFN-γ)产生的调控作用。方法:化学合成针对人t-bet基因的小干扰RNA(siRNA),转染体外培养的人γδT细胞和αβT细胞,利用流式细胞仪分选纯化CD8+T细胞和δγT细胞,半定量RT-PCR检测CD8+T细胞和γδT细胞中t-bet mRNA的表达变化,流式细胞术检测转染前后IFN-γ产生的变化情况。结果:转染siRNA后的人CD8+T细胞和γδT细胞t-bet mRNA表达强度分别为(24.75±1.18)%和(25.28±1.04)%,较转染前明显减小(P<0.05);在t-bet表达受到抑制的同时,γδT细胞中IFN-γ+细胞为(56.57±6.67)%,与错义序列组比较差异有显著性(P<0.05)。结论:siRNA可有效降低人CD8+T细胞和γδT细胞t-bet的基因表达,转录因子t-bet在γδT细胞IFN-γ产生中所起的作用与CD8+T细胞不完全相同。
- 汪洪涛薛祝平李柏青
- 关键词：T-BETSIRNA
- siRNA沉默t-bet基因对CD4、CD8T淋巴细胞亚群IFN-γ产生的影响
- 2009年
- 利用化学合成针对人t-bet基因的小干扰RNA(siRNA),转染体外培养的人外周血单个核细胞,利用流式细胞仪分选纯化CD4+、CD8+T淋巴细胞,半定量RT-PCR检测CD4+、CD8+T淋巴细胞中t-betmRNA的表达变化,流式细胞术检测转染前后IFN-γ产生的变化情况。探讨转录因子t-bet对人CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群IFN-γ产生的调控作用。与对照组相比,转染后的人CD4+、CD8+T淋巴细胞t-betmRNA表达水平明显下降;转染siRNA后,CD4+T淋巴细胞中IFN-γ+细胞比例为(18.46±6.86)%,与对照组(50.20±5.91)%比较有显著性差异(P<0.01);CD8+T淋巴细胞IFN-γ+细胞比例为(74.18±9.33)%,和对照组(76.51±6.49)%比较差异不明显(P>0.05)。体外转录合成的siRNA可有效降低人CD4+、CD8+T淋巴细胞t-bet的基因表达;转录因子t-bet对人不同淋巴细胞亚群IFN-γ的产生所起作用不同。
- 汪洪涛葛晓松李柏青
- 关键词：SIRNAT-BETIFN-Γ
- 蛋白激酶Cθ信号途径在结核分枝杆菌抗原激活人γδT细胞增殖和分化中的作用被引量：1
- 2008年
- 目的研究蛋白激酶Cθ（protein kinase Cθ，PKCθ）信号途径在结核分枝杆菌抗原（Mycobacterium tubemulosis antigen，Mtb—Ag）激活人γδT细胞增殖和分化中的作用。方法健康人外周血单个核细胞（PBMC）用Mtb—Ag和IL-2优势刺激和扩增γδT细胞，或预先用5．0umol／L Rottlerin（楸毒素）预处理，培养不同时间后，用流式细胞术（FCM）检测γδT细胞表面活化分子和细胞因子表达；同时采用活体染料羧基荧光素乙酰乙酸（CFSE）标记细胞，流式细胞术分析Mtb—Ag刺激γδT细胞后的增殖和各子代细胞百分率。结果PBMC经Mtb—Ag刺激后3d，γδT细胞CD69和CD25表达分别为46．2％和45．6％，而Rottlerin预处理显著地抑制了CD69和CD25表达（P〈0．01）；PBMC经Mtb—Ag激活培养5、10和15d，培养扩增细胞中的γδT细胞比例分别为9．6％、54．6％和82．4％，其中第5天已有少部分1趼细胞发生增殖，第10天和第15天时几乎全部γδT细胞分裂都在6代以上，用Rotderin预处理，显著抑制了γδT细胞增殖反应，但在培养第10天后仍有少部分γδT细胞发生增殖反应；同时在培养第7天、14天和21天，用PMA（佛波酯）＋Ionomyein（离子霉素）再刺激后，产生IFN-γ的γδT细胞均在80％左右；培养21d时，有2．6％的γδT细胞表达IL-4。在Rottlerin预处理组产生TH1型细胞因子IFN-γ的γδT细胞均显著减少（P〈0．05），而γδT细胞表达TH2型细胞因子IL-4则几乎完全抑制（P〈0．01）。结论PKCθ信号途径在Mtb—Ag刺激γδT细胞的增殖和分化中均起重要作用。
- 朱安友陈礼文王凤超李兴武葛鑫唐洁李柏青
- 关键词：ΓΔT细胞蛋白激酶CΘ结核分枝杆菌抗原
- 转录因子RORγt对T细胞亚群产生IFN-γ的调控作用被引量：1
- 2008年
- 目的:探讨转录因子维A酸相关孤独受体γt(RORγt)对T细胞亚群产生IFN-γ的调控作用。方法:健康成人外周血单个核细胞用CD3单克隆抗体和IL-2激活和扩增T细胞,活化T细胞用脂质体法转染人工合成的RORγt基因特异性短干扰RNA(siRNA)序列3个片段(RORγt-siRNA-982,-1026,-1197),RT-PCR半定量法检测活化T细胞转染siRNA后RORγt基因表达,流式细胞仪检测不同T细胞亚群产生IFN-γ细胞的比例。结果:活化T细胞转染RORγt-siRNA后,对RORγt基因表达的检测显示,RORγt-siRNA-982序列无抑制作用,而RORγt-siRNA-1026和-1197序列均有明显抑制作用。活化T细胞转染RORγt-siRNA-1026后,产生IFN-γ细胞百分数在CD4+T细胞(32.78±3.41)中,明显低于未转染组(44.54±1.75)(P<0.01)。结论:转录因子RORγt对T细胞,特别是对CD4+T细胞产生IFN-γ有正调控作用。
- 薛祝平马飞唐洁李柏青
- 关键词：T细胞Γ-干扰素流式细胞术
- 人工合成的siRNA转染外周血活化T淋巴细胞方法学研究被引量：2
- 2009年
- 观察人工合成siRNA与脂质体DMRIE-C Reagent的复合物对人外周血活化T淋巴细胞转染效果。人外周血标本中分离的外周血单个核细胞用抗原和IL-2刺激扩增培养,产生活化的T淋巴细胞,用不同配比浓度的荧光标记的siRNA-FAM与脂质体的复合物转染活化后的T淋巴细胞,分别采用转染一次和连续转染两次的方法,并在转染后4h,分别取样本,通过流式细胞测定技术,比较两种方法的转染效率,并筛选出最佳转染效率剂量配比。活化T细胞用转染一次和两次的方法后,平均转染阳性率分别为(12.5±0.64)%和(50.37±6.77)%。采用连续两次转染的方法进行转染,转染效率要明显高于一次转染法。
- 葛晓松薛祝平李柏青
- 关键词：SIRNA转染脂质体
- 蛋白激酶Cθ在γδT细胞表达L-选择素中的调控作用
- 2009年
- 目的探讨蛋白激酶Cθ（PKCθ）信号转导途径在γδT细胞表达L-选择素（CD62L）中的调控作用。方法用结核分枝杆菌抗原（Mtb-Ag）刺激人外周血单个核细胞（PBMC）并培养6～8d，获得富含γδT细胞的结核分枝杆菌活化T细胞（MtbAT），作为γδT细胞来源，分别加佛波醇酯（PMA）、PMA＋离子霉素（IMN）培养3、6、12、24h，或用培养8d的MtbAT细胞分别加入Mtb—Ag、Rottlerin＋Mtb-Ag、PMA、Rottlerin＋PMA刺激4h，收集细胞用荧光抗体染色后，流式细胞术（FCM）检测CD62L在18T细胞表面的表达。结果体外激活培养6～8d的18T细胞表面CD62L的表达率为75．0％～87．0％。PMA刺激78T细胞3～12h时CD62L表达逐渐下调，表达率为42．3％～25．5％；但在刺激后24h时，又明显回升至53．2％。而PMA＋IMN刺激3、6h时，18T细胞CD62L表达也下调，表达率分别为52．1％、39．3％；但在刺激12h和24h时CD62L表达率分别为52．9％和35．3％。在PMA刺激γδT细胞同时加入Rottlerin，则CD62L的表达率（47．9％）明显高于PMA单独刺激组（31．8％）；MtbAT用Mtb—Ag再刺激4h后，γδT细胞CD62L的表达率由70．0％降为54．8％，而在Mtb．Ag再刺激时加入Rottlerin，则CD62L表达率增加到63．1％。结论γδT细胞在PMA或Mtb-Ag刺激后CD62L的表达下调可被PKCθ特异性抑制剂部分阻断，表明CD62L在γδT细胞表面的表达可能与PKCθ信号转导途径的调控相关。
- 武文娟耿英华唐洁李柏青
- 关键词：L-选择素ΓΔT细胞蛋白激酶C
- siRNA对γδT细胞Eomes基因表达的抑制功能研究
- 2010年
- 本文旨在探讨RNA干扰对人外周血γδT细胞Eomes基因的表达和产生IFN-γ的抑制效应。化学合成3对EomessiRNA,脂质体转染试剂介导siRNA转染到用结核杆菌(Mtb)抗原刺激的人外周血单个核细胞中(主要是γδT细胞),通过转染条件优化后,对转染了siRNA的γδT细胞采用流式细胞术(FCM)进行分选,利用RT-PCR检测转染细胞EomesmRNA表达抑制率,以FCM检测转染前后γδT细胞IFN-γ产生的情况。结果显示,有2对siRNA能有效抑制Eomes的mRNA表达,并对γδT细胞IFN-γ的产生起抑制作用。提示Eomes siRNA可特异地抑制γδT细胞Eomes基因表达,Eomes可能是调控γδT细胞产生IFN-γ的重要转录因子。
- 汪洪涛葛晓松李柏青
- 关键词：SIRNAΓΔT细胞
- 转录因子T-bet和Eomes对不同亚类人T细胞产生IFN-γ的调控作用被引量：4
- 2010年
- 目的:探讨转录因子T-bet和Eomes对不同亚类人T细胞产生IFN-γ的调控作用。方法:化学合成针对人T-bet和Eomes基因的小干扰RNA(siRNA),转染体外培养的CD3单克隆抗体(mAb)活化的αβT细胞和Mtb-Ag活化的γδT细胞,利用流式细胞仪分选纯化CD4+、CD8+T细胞和γδT细胞,半定量RT-PCR检测CD4+、CD8+T淋巴细胞中T-bet和EomesmRNA的表达变化,流式细胞术(FCM)检测转染前后IFN-γ产生的变化情况。结果:经过连续2次转染,siRNA-FAM+细胞可达50%。转染T-bet-siRNA后,CD4+T细胞IFN-γ+细胞率(18.46±6.86)%,比阴性对照组(50.20±5.91)%,明显降低(P<0.01),而CD8+T细胞转染T-bet-siRNA,IFN-γ+细胞率(74.18±9.33)%,与阴性对照组(76.51±6.49)%无统计学意义;转染Eomes-siRNA,CD4+T细胞IFN-γ+细胞率(50.92±6.78)%,与对照组无统计学意义;而CD8+T细胞IFN-γ+细胞率(25.37±7.11)%,比阴性对照组(76.51±6.49)%,明显降低(P<0.01)。MtbAT转染T-bet-siRNA和Eomes-siRNA后,γδT细胞IFN-γ+细胞率分别为(56.57±6.67)%和(42.53±5.13)%,比阴性对照组(76.52±2.58)%均明显降低(P<0.01)。结论:在转录因子水平,T-bet和Eomes分别是调控CD4+、CD8+T淋巴细胞IFN-γ产生的重要转录因子,而两者可能同时参与了γδT细胞IFN-γ产生的调节。
- 汪洪涛葛晓松薛祝平李柏青
- 关键词：SIRNAT-BETIFN-Γ
