博士科研启动基金(2010RCB52) 作品数:8 被引量:16 H指数:2 相关作者: 李德山 王文飞 任桂萍 刘铭瑶 赵景壮 更多>> 相关机构: 东北农业大学 更多>> 发文基金: 博士科研启动基金 黑龙江省科技攻关计划 国家自然科学基金 更多>> 相关领域: 医药卫生 生物学 更多>>
不同活动、饥饿和饮食成分状态下FGF21的动力学表达 被引量:1 2012年 成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor,FGF21)是FGF家族中的新成员.目前研究显示,FGF21是一个新的糖脂代谢调节因子,有望成为治疗糖尿病的新型药物.为探讨FGF21的生理功能,利用real-time PCR和Western印迹,检测FGF21在不同生理或病理状态下基因水平和蛋白水平的表达量变化规律.实验结果显示,在全天24 h中,小鼠肝脏中FGF21在晚18点至21点,表达量显著升高,这可能与啮齿类动物傍晚活动加强及进食习性有关;FGF21在饥饿后表达量显著升高,在饥饿后喂食FGF21的表达量下降,并且随着饥饿时间的延长,FGF21的表达量升高,说明FGF21与饥饿程度呈正相关;灌注葡萄糖后20 min内,FGF21的表达量下降,而灌注脂肪乳20 min内,FGF21的表达量上升,说明葡萄糖是FGF21的负调节因子,而脂肪乳是FGF21的正调节因子;利用谷氨酸钠造模的肥胖小鼠,肝脏中FGF21的表达量显著高于同龄对照组,说明肥胖可诱导FGF21高表达.综上所述,FGF21的表达量变化与小鼠夜间活动取食、饥饿程度、饮食中不同的成分以及肥胖有关. 李晋南 张振宇 王文飞 陈睿 赵景壮 任桂萍 李德山关键词:成纤维细胞生长因子21 REAL-TIME PCR FGF-21促进HepG2细胞摄取葡萄糖研究 被引量:2 2016年 肝脏是代谢的中枢性器官,在糖脂代谢中扮演重要角色。FGF-21是近年来发现的一种治疗糖尿病新型药物,研究其对肝脏糖代谢影响及机制将为FGF-21成药性提供理论依据。以Hep G2细胞为肝细胞模型,探究FGF-21对Hep G2细胞葡萄糖吸收影响及作用机制。FGF-21处理Hep G2细胞,采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(GOD-POD)法检测细胞对葡萄糖摄取情况,并检查胰岛素与FGF-21协同作用,蒽酮法检测细胞内糖原含量,半定量和实时荧光定量PCR检测FGF-21对葡萄糖转运蛋白(GLUTs)m RNA表达影响。结果表明,FGF-21可促进Hep G2细胞摄取葡萄糖,与胰岛素具有一定协同作用,增加糖原合成。半定量PCR结果显示在FGF-21作用下,仅GLUT1m RNA表达有所增加。实时荧光定量PCR检测FGF-21作用时间对GLUT1 m RNA表达量影响,发现FGF-21作用6 h时GLUT1 m RNA表达量倍数增加最大。说明FGF-21可通过增加GLUT1 m RNA表达促进Hep G2细胞消耗葡萄糖,参与糖原合成。 刘铭瑶 王文飞 侯玉婷 任桂萍 吴云舟 李德山关键词:糖尿病 糖代谢 FGF-21 HEPG2 快速筛选高水平稳定表达成纤维细胞生长因子-21真核细胞株新方法的建立 被引量:1 2012年 成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)是成纤维细胞生长因子家族的一名新成员,其研究已成为世界糖尿病研究的新热点,并有望成为治疗2型糖尿病的新型药物.然而,应用真核表达系统,更加快速、高效生产更接近天然状态的FGF-21蛋白并对其生物学功能进行的研究,至今尚未报道,因此建立高效稳定的FGF-21真核表达系统至关重要.本研究以FGF-21为目的基因,利用谷氨酰胺合成酶基因(GS)和绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,分别构建了单基因表达载体Pee12.4-FGF-21-Pee6.4-EGFP(Peedual)、Pee12.4-FGF-21-IRES-EGFP(PeeIRES)和双基因的真核表达载体Pee12.4-FGF-21-IRES-EGFP-Pee6.4-FGF-21(Peedual-IRES),分别转染CHO-K1SV细胞后,通过GS加压和流式细胞术(在488 nm波长的激发光下能检测到EGFP绿色荧光)双筛选系统快速有效获得了稳定高效表达目的蛋白的细胞系.应用SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测细胞系目的蛋白的表达及差异,并通过HepG-2细胞糖吸收模型进行蛋白活性检测.研究结果表明:两个筛选系统结合使用,更好更快地筛选到了稳定转染并高效表达目的蛋白的细胞系,而且与单基因的载体相比,双基因载体Peedual-IRES在操作条件一致的情况下,目的蛋白表达量显著提高且均具有生物活性.本研究建立了省时、高效的真核表达平台,为FGF-21在真核水平上的高表达提供了一个新的方法. 张雅坤 王文飞 何昆 叶贤龙 刘淼 韩苗苗 刘铭瑶 李德山关键词:真核表达 流式细胞术 FGF-21 聚乙二醇修饰的成纤维细胞生长因子-21的降血糖作用 2013年 成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)是FGF家族的一员.现有大量研究表明,FGF-21是除胰岛素以外的一种新的血糖调节因子,有望成为治疗2型糖尿病的新型药物.然而,FGF-21在动物体内稳定性较差,半衰期较短,严重影响了其在临床上的应用.为解决这些问题,本实验采用分子质量为20 ku的单甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)对鼠源FGF-21(mFGF-21)进行N端定点修饰,以改善mFGF-21的性质(如提高体内半衰期、降低免疫原性等).本文研究了反应pH、反应时间、蛋白质浓度及反应物之间的质量比对mFGF-21与聚乙二醇(PEG)合成反应的影响.采用Capto Q阴离子交换层析或Superdex 75凝胶过滤层析分离纯化聚乙二醇化mFGF-21(PEG-mFGF-21),并最终确定了mFGF-21聚乙二醇修饰的反应条件和分离PEG-mFGF-21的纯化工艺.随后分别进行了PEG-mFGF-21的理化性质(大小、纯度和体外稳定性)、免疫原性、体内半衰期、体外葡萄糖吸收活性及体内降糖活性的研究.体外稳定性实验结果显示,mFGF-21经PEG修饰后温度稳定性和抗蛋白酶水解稳定性都显著提高.间接ELISA方法检测血清中mFGF-21抗体水平及目标蛋白含量的结果表明,PEG修饰mFGF-21可明显降低其免疫原性,延长体内半衰期.HepG2细胞的葡萄糖吸收实验结果发现,PEG-mFGF-21的细胞活性并没有下降,反而随着刺激细胞时间的延长,经PEG-mFGF-21刺激的细胞葡萄糖吸收显著高于mFGF-21刺激的细胞葡萄糖吸收.2型糖尿病db/db小鼠短期血糖调控实验结果表明,mFGF-21降糖速度快于PEG-mFGF-21,但其持续时间较PEG-mFGF-21短;长期血糖调控实验结果显示,PEG-mFGF-21长期降糖效果优于mFGF-21,作用持续时间长,并且PEG-mFGF-21在停药后控制血糖的能力也高于mFGF-21.综上所述可知,mFGF-21的PEG修饰在不影响其体外生物活性的前提下,能够提高mFGF-21的物理稳定性和抵抗蛋白酶水解的能力、降低免疫原性、增加体内稳定性、延长 叶贤龙 赵景壮 任桂萍 于丹 刘铭瑶 于引航 李德山关键词:聚乙二醇化 葡萄糖吸收 人成纤维细胞生长因子-21单克隆抗体的制备及抗原表位的确定 被引量:2 2013年 目的 制备小鼠抗人成纤维细胞生长因子(hFGF)-21单克隆抗体(mAb), 通过细菌展示确定该mAb的抗原表位。方法 用hFGF-21作为检测和免疫抗原, 间接ELISA筛选分泌抗人hFGF-21 mAb的杂交瘤细胞株; 用FITC标记该mAb, 并克隆hFGF-21的不同片段到展示载体Apex上, 通过流式细胞仪筛选其抗原表位。结果 成功筛选出1株抗hFGF-21抗体的细胞株, 其分泌抗体重链的亚型为IgG 2b, 轻链为Kappa链; 该杂交瘤细胞株腹水的效价为1∶4.096×10^6; 传30代及液氮中保存3个月, 该细胞株能稳定分泌抗hFGF-21 mAb, 且效价稳定; Western blot法检测证明该抗体与人FGF-21有很好的特异性; 该mAb与小鼠FGF-21有交叉反应; 通过流式细胞仪对抗原表位的筛选, 该mAb可与hFGF-21下游的第107-121个氨基酸反应。结论 成功的制备出特异性、高稳定性的小鼠抗hFGF-21 mAb, 确定了该mAb的抗原表位在第107~121位氨基酸。 郝智超 徐黎明 白银 王琪 王文飞 李德山关键词:单克隆抗体 流式细胞术 精氨酸修饰成纤维细胞生长因子21及修饰后蛋白体内稳定性和糖代谢调节作用的研究 被引量:2 2012年 成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor21,FGF21)是2000年发现的一个不依赖胰岛素调节血糖的细胞因子,有望成为治疗糖尿病的候选药物.但是,野生型FGF21由于半衰期较短,在体内不稳定,从而影响其成药性.为提高FGF21的稳定性,本实验在FGF21的C端添加了2个精氨酸(arginine,Arg),命名为FGF21-2A,用Compute pI/Mw软件计算之后,等电点(isoelectric point,pI)从5.43上升到5.84,随后进行了蛋白质的表达、分离纯化、体内稳定性及糖代谢调节作用的研究.诱导表达后菌液的SDS-PAGE图经BandScan5.0分析后显示FGF21-2A的表达量相对于野生型FGF21提高了10.6%.家兔体内半衰期检测实验结果显示FGF21-2A的半衰期显著延长.GOD-POD法检测HepG2肝癌细胞葡萄糖吸收实验、糖尿病小鼠降血糖实验和肝糖原检测实验的结果证明,FGF21-2A的降糖效果得到了增强,并且持续时间相对于野生型FGF21显著延长.Real-time PCR结果发现,长期注射FGF21-2A显著提高了糖尿病小鼠肝脏内葡萄糖转运蛋白(GLUT)1和葡萄糖激酶(GK)mRNA的表达量,降低了葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)的mRNA表达量,表明FGF21-2A调节糖代谢的机制与野生型FGF21一致.综上所述,精氨酸修饰的FGF21其蛋白质稳定性提高,进而增加了对血糖的调控效果,有望成为新型糖尿病药物. 何昆 张雅坤 叶贤龙 王文飞 陈睿 刘铭瑶 冯明芳 许嘉玲 李德山关键词:精氨酸 成纤维细胞生长因子21在抵抗素引发胰岛素抵抗的肝细胞模型中的糖代谢调节作用 被引量:3 2013年 抵抗素是2001年Steppan等发现的一种与胰岛素抵抗有密切联系的细胞因子.本研究探讨了成纤维细胞生长因子21(FGF-21)在抵抗素过表达导致胰岛素抵抗的肝细胞中的糖代谢调节作用.构建人抵抗素真核表达载体,转染HepG2细胞,利用流式细胞仪筛选出过表达抵抗素的HepG2模型细胞,分别用不同浓度的胰岛素和FGF-21刺激细胞,用GOD-POD法检测细胞的葡萄糖摄取情况,利用实时荧光定量PCR方法检测抵抗素转染后及FGF-21处理后细胞GLUT1、PPAR-γmRNA表达的变化.PCR鉴定结果表明过表达抵抗素的HepG2模型细胞构建成功.GOD-POD法检测结果证明,模型细胞对胰岛素敏感性降低,但FGF-21仍能有效调节模型细胞的葡萄糖摄取,且呈现剂量依赖关系.实时荧光定量PCR方法检测发现,抵抗素转染后HepG2细胞GLUT1 mRNA表达增加,经FGF-21刺激后模型细胞与对照细胞相比GLUT1 mRNA的表达仍有上升趋势,PPAR-γ的变化不显著.上述结果表明,抵抗素过表达的肝细胞,对胰岛素敏感性降低,产生胰岛素抵抗,但FGF-21仍能有效调节其葡萄糖代谢. 刘淼 王文飞 刘铭瑶 赵景壮 白银 郭茉 任桂萍 李德山关键词:抵抗素 胰岛素抵抗 HEPG2 FGF21基因优化及其生物活性研究 被引量:6 2012年 成纤维细胞生长因子21(FGF21)是FGF家族的一员,它具有独立、安全以及有效地调节生物体内血糖水平的能力。为了提高FGF21蛋白的活性,将人FGF21(hFGF21)与鼠FGF21(mFGF21)的功能区互换,构建了一种新的FGF21基因(命名为hmFGF21)。通过基因重组的方法构建SUMO-hmFGF21表达载体后,转化大肠杆菌Rosetta中诱导表达。对融合蛋白进行纯化和酶切,获得的hmFGF21突变体纯度在95%以上,并在细胞水平和动物水平上检测了突变体的生物学活性。结果表明,与野生型hFGF21相比,相同菌量hmFGF21可溶性蛋白表达量提高了约2倍。人肝细胞模型HepG2的糖吸收实验显示,hmFGF21的葡萄糖吸收显著优于野生型hFGF21。2型糖尿病动物速效降糖实验和长效降糖实验表明,hmFGF21的降糖效果显著优于野生型hFGF21。这些结果说明,野生型hFGF21经优化改造后显著提高了其生物学活性。 叶贤龙 高华山 王文飞 任桂萍 刘明瑶 何昆 张雅坤 赵景壮 于丹 李德山关键词:葡萄糖吸收 2型糖尿病