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沙蚕激酶全基因在大肠杆菌中表达及溶栓作用检测: 2008年; 目的使沙蚕激酶全基因在大肠杆菌中高效表达获得沙蚕激酶,并检测其溶栓活性。方法通过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切将沙蚕激酶全基因克隆进载体pGEX4T-2,诱导表达后SDS-PAGE证实该基因正常表达。构建大鼠颈动-静脉旁路血栓模型,进行目的蛋白溶栓作用检测。结果沙蚕激酶使血栓湿质量减小,优球蛋白溶解时间(ELT)缩短(F=19.112、20.390,P<0.05),但对纤维蛋白原(FIB)影响不明显(F=1.333,P>0.05)。结论沙蚕激酶基因表达的目的蛋白有抑制血栓形成、激活纤溶活性的作用。; 陆国辉赵百慧李泰东张贵芝王斌闫志勇金毅; 关键词：基因表达纤维蛋白溶解

沙蚕消化道产蛋白酶菌D2株的筛选及其酶学性质被引量：15: 2007年; 目的从海洋生物双齿围沙蚕消化道筛选产蛋白酶菌株,并对其胞外蛋白酶的性质进行分析。方法用脱脂奶粉平板溶圈法及改良Lowry法进行产蛋白酶菌株的筛选和蛋白酶活力测定;Bradford法测定蛋白含量;UVP GDS8000型凝胶成像系统和VisionWorks、Bandscan4·03软件进行相对分子质量和纯度分析,并对酶的各项性质进行检测。结果筛选出高蛋白水解活性菌株D2,其胞外蛋白酶比活性为156·0U/mg,相对分子质量约为42000,纯度大于97%,最适作用温度60℃,最适pH为9,在pH6～10及0～55℃具有较好的稳定性。结论D2株分泌的胞外蛋白酶有望成为一种新型的海洋微生物蛋白酶资源。; 代玉梅闫志勇王斌钱冬萌宋旭霞丁守怡刘明军张艳丽; 关键词：双齿围沙蚕胞外蛋白酶酶学性质

沙蚕消化道细菌D2胞外蛋白酶的分离纯化及其性质被引量：8: 2008年; 目的分离纯化沙蚕消化道菌D2胞外蛋白酶,并对其性质进行分析。方法收集48 h发酵液上清,经80%饱和硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析、Superdex G-75凝胶过滤层析逐步纯化D2蛋白酶,分析其酶学性质,并用ESI-MS/MS测定其酶解后的部分氨基酸序列。结果经纯化,得到电泳纯的D2蛋白酶,纯化倍数为4.9倍,活性回收率为33%,相对分子质量约42 000,纯度大于99%;最适作用温度为60℃,最适pH为9,在pH6-11及0-60℃具有较好的稳定性,水解酪蛋白的Km值为2.44 mg/ml;Cu2＋、Ca2＋、Mg2＋、K＋等金属离子对酶活力有明显促进作用,EDTA和PMSF对酶活力有强烈抑制作用;该酶对尿素、SDS、DTT等变性剂有较好的耐受性,其两个内部肽段经质谱测序,序列分别为AHGFLPLTK和APSATG-GSALYPLEFVVGK。结论该酶为一高温碱性丝氨酸蛋白酶,具有较高的工业开发价值和较大的应用潜力。; 代玉梅闫志勇王斌钱冬萌宋旭霞丁守怡刘明军张艳丽; 关键词：消化道蛋白酶

基因重组沙蚕纤溶活性蛋白的克隆、表达和活性检测被引量：6: 2007年; 目的从双齿围沙蚕消化道中克隆并表达具有纤维蛋白溶解活性的蛋白。方法提取沙蚕消化道上皮细胞RNA,逆转录获得cDNA。根据丝氨酸蛋白酶家族基因保守序列设计兼并引物,筛选包含丝氨酸蛋白家族保守位点的阳性克隆,进行核苷酸测序。根据该序列利用5′RACE技术进行扩增,将获得的基因片段克隆到pMAL-p2载体中,在大肠杆菌BL21中进行融合表达。表达的融合蛋白经过直链淀粉树脂亲和色谱和DEAE-Sepharose 4B纯化后,纤维蛋白平板法检测其溶栓活性。结果cDNA经5′RACE扩增获得长度为260 bp的基因片段,推测其包含可编码83个氨基酸的完整序列(约9.0×103);重组pMAL-p2表达出51.0×103的融合蛋白,经过测定具有明显的溶栓活性。结论从双齿围沙蚕中克隆获得的基因片段表达的融合蛋白具有溶栓活性,有望成为一种新型的纤溶药物。; 闫志勇李荣贵赵百慧宋旭霞丁守怡钱冬萌王斌; 关键词：双齿围沙蚕纤溶酶基因克隆

嗜麦芽寡养单胞菌D2株基因组文库的构建及部分克隆的分析被引量：5: 2010年; 目的自双齿围沙蚕消化道内分离出的嗜麦芽寡养单胞菌D2株经前期研究发现其具有明显胞外分泌可溶性纤溶酶、蛋白酶等活性。文中构建嗜麦芽寡养单胞菌D2株基因组文库,了解其基因背景。方法用Sau3AⅠ酶切D2株基因组DNA,回收0.2~2kb的DNA片段,连接至pMD18-T质粒载体,转化大肠杆菌JM109,在含有Amp的LB平板上筛选重组子,酶切鉴定后建库保存;随机挑取15个酶切鉴定正确的阳性克隆测序,在网络数据库中进行BLASTX分析。结果共得到转化子约1124个,符合建库要求;经测序证实获得了D2株碱性磷酸酶、AMP-依赖性合成酶、荧光素样单加氧酶等蛋白的结构基因序列。结论成功构建了嗜麦芽寡养单胞菌D2株的基因组文库,为进一步了解该菌的背景及筛选其功能基因奠定基础。; 杨丽闫志勇王斌辛晓妮宋旭霞赵巍钱冬萌苏洁; 关键词：嗜麦芽寡养单胞菌基因组文库克隆

一株具有纤维蛋白溶解活性的海单胞菌的分离和鉴定被引量：10: 2007年; 目的对从双齿围沙蚕消化道内分离的菌株Y5进行纤维蛋白溶解活性检测及系统分类鉴定。方法用纤维蛋白平板法检测Y5的纤维蛋白溶解活性,并从形态、生理、生化、DNA(G+C)含量、脂肪酸成分、16S rRNA基因序列及系统发生分析等方面进行分类鉴定。结果菌株Y5为革兰阴性杆菌;DNA(G+C)含量为47.5%;主要脂肪酸成分为C_(18:1)ω7c,C_(16:1)ω7c,C_(16:0),C_(10:0)3-OH;16S rRNA基因序列与9种已确定的海单胞菌一致性为93%～97%;在系统发生树中与其他海单胞菌位于同一类群中;该菌株在纤维蛋白平板上显示出明显的纤维蛋白溶解活性。结论菌株Y5属于海单胞菌属。该菌株具有纤维蛋白溶解活性,有望为开发溶栓药物提供又一重要资源。; 闫志勇王斌宋旭霞李荣贵钱冬萌丁守怡; 关键词：纤维蛋白溶解活性双齿围沙蚕

海单胞菌1株的分离和系统发育分析被引量：4: 2009年; 目的对从双齿围沙蚕消化道内分离出的菌株Y5进行系统鉴定。方法通过形态学、生理学、气相色谱法、(G+C)mol%、16SrRNA基因序列测定以及系统发育分析,鉴定该细菌的种属。结果菌株Y5为革兰阴性细菌,直杆状,无芽孢,无鞭毛,大小为(0.5～1.0)μm×(1.5～3.0)μm;生长温度范围4～40℃;具有嗜盐性,NaCl耐受范围10～130g/L;氧化酶、过氧化氢酶、精氨酸双水解试验阳性,不还原硝酸盐;可利用葡糖糖、麦芽糖且为惟一碳源;精氨酸脱羧试验阳性;细胞主要脂肪酸成分C18:1ω7c为41.0%、C16:1ω7c为25.5%、C16:0为12.9%,C10:03-OH为7.8%。DNA的(G+C)mol%为47.5%。菌株Y516SrRNA基因序列与9种已确定的海单胞菌相似度为93%～97%。根据16SrRNA基因序列构建的系统发育树显示,该菌株与其他海单胞菌位于系统发育树的同一类群中。结论该细菌属海单胞菌属,并且可能为海单胞菌属的一个新种,暂命名为沙蚕海单胞菌(M.aibu-hitensis sp.nov)。; 杨丽闫志勇宋旭霞王斌; 关键词：双齿围沙蚕 RRNA 系统发育分析

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重大基础研究前期研究专项(2004CCA02400)