国家自然科学基金(30901642)
- 作品数：5 被引量：15H指数：3
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- 先天性视网膜劈裂的RS1基因突变型及其与临床表型相关性研究被引量：4
- 2011年
- 目的观察先天性视网膜劈裂（XLRS）患者的基因突变型及其与临床表型的相关性。方法33例XLRS患者、26名女性携带者和100名无眼疾的健康正常对照人群纳入研究。33例患者来自8个家系18例；散发病例15例。均为男性，双眼发病。66只眼中，黄斑中心凹微囊样劈裂49只眼，占74．2％；黄斑部层状劈裂43只眼，占65．2％；视网膜周边部劈裂32只眼，占48．5％。视网膜脱离17只眼，占25．8％；合并玻璃体积血9只眼，占13．6％。行视网膜电图（ERG）检查的42只眼均表现为不同程度b波振幅降低。采用聚合酶链反应（PCR）方法，对视网膜劈裂基因（RS1基因）的6个外显子各片段进行扩增后直接DNA测序，明确基因突变位点和突变类型。同时对基因型与临床表型问进行相关性分析。结果DNA测序发现19种不同的RS1基因突变。其中，新发现6种，分别是p．Gly70Cys、P．Trpll2Arg、P．Argl56Trp、P．HisZ07ProfsX56、P．Arg209AlafsX28、P．Cys223Tyr。正常对照人群未检测到基因突变。相关性分析结果显示，基因型与临床表型间无相关性（x2=0．731，3．438，0．820，3．208，1．992；P〉0．05）。结论RS1基因突变是导致XLRS的主要原因；RS1基因突变型与临床表型间无相关性，不能通过基因型来预测疾病的预后。
- 余洪华李涛雷蕾丁小燕李加青胡洁朱晓波罗燕李士清胡安娣娜唐仕波
- 关键词：基因突变
- 重组AAV2-色素上皮衍生因子对人视网膜微血管内皮细胞增殖的影响被引量：3
- 2011年
- 目的 体外培养人视网膜微血管内皮细胞,探讨重组rAAV2-色素上皮衍生因子（PEDF）对该细胞在不同氧环境下增殖的影响.方法 实验研究.2%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶消化视网膜,获得视网膜微血管内皮细胞;接种于预先包被纤维连接蛋白的培养瓶内,用含10%胎牛血清、内皮细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒添加物的内皮细胞培养基,置于5%CO237 ℃培养箱内培养.相差显微镜观察细胞形态及生长情况.抗第Ⅷ因子相关抗原抗体鉴定内皮细胞.以125 μmol/L CoCl2建立HRCECs化学低氧模型,观察低氧对内皮细胞增殖的影响.按照105病毒基因组数/细胞的剂量进行rAAV2-PEDF病毒转染,分别设空白和阴性对照,激光共焦显微镜下观察EGFP阳性细胞,免疫印迹法检测PEDF蛋白表达.MTT法测定rAAV2-PEDF对不同氧条件下对细胞增殖的影响.流式细胞仪检测rAAV2-PEDF对不同氧条件下对细胞凋亡的影响.两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用方差分析.结果 原代培养的人视网膜微血管内皮细胞48～72 h贴壁,2周左右细胞融合.第Ⅷ因子相关抗原鉴定细胞呈阳性.转染病毒48 h后,激光共焦显微镜下观察可见EGFP阳性细胞,免疫印迹法检测,实验组PEDF表达明显强于其他组.MTT结果显示,单纯低氧处理,正常对照组A值为0.085±0.021,实验组A值为0.166±0.024（t=3.938,P＜0.05）.rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,A值分别为：正常对照组0.171±0.011,rAAV2-EGFP组0.178±0.016,rAAV2-PEDF组0.169±0.017（F=0.01,P＞0.05）.rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,A值分别为：单纯CoCl2组0.166±0.013,CoCl2＋rAAV2-EGFP组0.155±0.012,CoCl2＋rAAV2-PEDF组0.116±0.015（F=6.25,3.50;P＜0.05）.rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,正常对照组凋亡细胞比例为2.3%,rAAV2-EGFP组为3.3%,rAAV2-PEDF组为1.7%.rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜�
- 李涛马红婕梁小玲丁小燕罗燕林少芬唐仕波
- 关键词：内皮细胞依赖病毒细胞增殖神经生长因子类舍平类
- 玻璃体视网膜手术治疗先天性视网膜劈裂及其并发症的疗效观察被引量：3
- 2012年
- 目的观察玻璃体视网膜手术治疗先天性视网膜劈裂（XLRS）及其并发视网膜脱离和（或）玻璃体积血的疗效。方法回顾分析接受玻璃体视网膜手术治疗的XLRS并发视网膜脱离和（或）玻璃体积血患者21例27只眼的临床资料。所有患眼眼底及光相干断层扫描（OCT）检查均发现黄斑微囊样劈裂病变合并周边部视网膜劈裂。平均视力0．11±0．09，黄斑劈裂平均面积为（1．09±0．56）mm2。12只眼并发孔源性视网膜脱离，5只眼并发牵拉性视网膜脱离，6只眼并发玻璃体积血，4只眼同时合并视网膜脱离和玻璃体积血。均行经扁平部三通道闭合式玻璃体切割手术。根据情况行内界膜剥离，眼内激光光凝，C3F8或硅油填充。手术后随访9～122个月，平均随访时间51个月。观察视力以及视网膜解剖结构改善情况。结果末次随访视力提高者20只眼，占74．1％；维持不变者7只眼，占25．9％。平均视力提高至0．26±0．15。与治疗前平均视力比较，差异具有统计学意义（t=-6．320，P=0．000）。27只眼视网膜解剖结构复位良好，视网膜平伏。OCT检查显示，黄斑劈裂平均面积（0．29±0．21）mm2，较治疗前黄斑劈裂平均面积显著缩小（t=10．358，P=0．000）；黄斑微囊样病变得到明显的改善。随访期间4只眼出现并发症，占14．8％。其中，2只眼分别在手术后6、8个月并发增生性玻璃体视网膜病变伴牵拉性视网膜脱离；1只眼在手术后4个月出现并发性白内障；1只眼在手术后15个月因新发视网膜裂孔而发生玻璃体积血。给予再次手术治疗后，4只眼视网膜复位良好。结论玻璃体视网膜手术能有效提高XLRS患者视力，恢复视网膜解剖结构，获得良好的治疗效果。
- 李涛余洪华李士清李加青胡洁朱晓波马伟袁玲唐仕波
- 重组腺相关病毒-色素上皮衍生因子抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的作用被引量：3
- 2010年
- 目的 观察重组腺相关病毒-色素上皮衍生因子（rAAV2-PEDF）对氧诱导小鼠视网膜新生血管（RNV）的作用.方法 选择3日龄C57/BL6小鼠22只,左眼为实验服,右眼为对照眼,微量注射器玻璃体腔分别注射rAAV2-PEDF和rAAV2-绿色荧光蛋白1μl.注射后立即将小鼠放入氧箱,建立氧诱导血管增生性视网膜病变模型.取13日龄小鼠4只提取视网膜总蛋白,蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测色素上皮衍生因子（PEDF）蛋白表达.17日龄小鼠12只,荧光素心脏灌注视网膜铺片观察血管形态和分布.17日龄小鼠6只,视网膜冰冻切片外源凝集素标记后染色观察血管形态和分布.Image-Pro Plus5.1软件测量分析无荧光素灌注区和RNV的绝对面积和相对面积.结果 实验眼PEDF蛋白表达显著高于对照眼.视网膜铺片定量结果显示,实验眼和对照跟绝对无灌注区面积分别为（0.96±0.22）、（1.96±0.34）mm^2,差异有统计学意义（t=-8.554,P〈0.01）;相对无灌注区面积分别为（8.64±1.52）%、（17.27±2.98）%,差异有统计学意义（t=-8.97,P〈0.01）.实验眼和对照眼绝对新生血管面积分别为（0.37±0.11）、（1.26±0.38）mm^2,差异有统计学意义（t=-7.8,P〈0.01）;相对新生血管面积分别为（3.96±0.66）%、（11.45±2.06）%,差异有统计学意义（t=-8.51,P〈0.01）.外源凝集素标记定量结果显示,实验眼和对照眼RNV面积分别为（0.11±0.003）、（0.41 4-0.02）mm^2,差异有统计学意义（t=-5.14,P〈0.01）.结论 rAAV2-PEDF可成功转染小鼠视网膜组织并稳定表达PEDF蛋白,不仅可以减少氧诱导血管增生性视网膜病变小鼠视网膜无灌注面积,而且可显著抑制RNV生成.
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- 关键词：细胞因子类基因转移技术
- 重组色素上皮衍生因子对人视网膜微血管内皮细胞迁移及凋亡的影响被引量：2
- 2010年
- 目的:构建rAAV2-PEDF腺相关病毒,研究色素上皮衍生因子(PEDF)基因高表达对人视网膜微血管内皮细胞的作用。方法:将PEDF基因克隆、重组到腺相关病毒载体pSNAV,得到的pSNAV-PEDF后转染BHK细胞,用含G418的培养基进行筛选,得到稳定转染pSNAV-PEDF的生产细胞系,用重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/△ UL2感染细胞进行病毒包装,纯化后得到高滴度rAAV2-PEDF病毒颗粒。按照105v.g./cell的剂量进行rAAV2-PEDF病毒转染,分别设空白和阴性对照,激光共聚焦显微镜下观察GFP阳性细胞,Western blotting检测PEDF蛋白表达。Boyden小室法观察细胞迁移情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:通过PCR、酶切及基因测序的方法,证实rAAV2-PEDF构建成功。转染病毒48h后,激光共聚焦显微镜下观察可见GFP阳性细胞,Western blotting检测,实验组PEDF表达明显强于其它组。rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,正常对照组凋亡细胞比例为2.10%±0.53%,rAAV2-GFP组为3.40%±0.62%,rAAV2-PEDF组为1.60%±0.47%,各组间无显著差异(P>0.05)。rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,单纯CoCl2组凋亡细胞比例为4.00%±0.55%,CoCl2+rAAV2-GFP组为6.10%±0.71%,CoCl2+rAAV2-PEDF组为40.00%±2.10%。rAAV2-PEDF组与其它2组相比,有显著差异(P<0.05)。细胞迁移计数显示,正常对照组为33.0±2.7,rAAV2-GFP组为35.0±3.6,rAAV2-PEDF组为12.0±2.1,rAAV2-PEDF组与其它2组相比,有显著差异(P<0.05)。结论:成功构建了rAAV2-PEDF,转染人视网膜血管内皮细胞后PEDF可稳定表达。PEDF高表达可显著抑制人视网膜微血管内皮细胞迁移并可在低氧条件下诱导其凋亡。
- 李涛李加青罗燕马红婕丁小燕袁玲马伟胡旭颋万婷唐仕波
- 关键词：腺相关病毒细胞迁移流式细胞术
