教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET070336)
- 作品数：5 被引量：31H指数：4
- 相关作者：闫云君徐莉赵鹤云刘云孙永川更多>>
- 相关机构：华中科技大学更多>>
- 发文基金：教育部“新世纪优秀人才支持计划”湖北省自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学化学工程更多>>
- 多拷贝毕赤酵母重组菌表达GCL摇瓶优化和高密度发酵被引量：4
- 2012年
- 目的:构建高效表达白地霉脂肪酶的毕赤酵母重组菌株,并对筛选得到的菌株进行摇瓶发酵条件优化和分批补料高密度发酵工艺研究。方法:将诱导型表达载体pPIC9K-gcl电转化至毕赤酵母GS115。通过橄榄油-罗丹明B平板和摇瓶发酵筛选高脂肪酶活力的重组菌株,运用基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR法确定其拷贝数,并对菌株进行摇瓶发酵条件优化。在此基础上,研究重组菌在3L发酵罐中的高密度发酵工艺。结果:筛选得到一株具有3个白地霉脂肪酶基因拷贝的菌株GS115/pPIC9K-gcl 78#,初始酶活力为220 U/ml。当摇瓶发酵条件为甲醇诱导96 h,每24 h甲醇添加量1%,接种量2%,培养基初始pH 7.0,500 ml摇瓶装液量50 ml,甲醇诱导温度25℃时酶活力达735 U/ml。3L发酵罐高密度发酵176.5 h,酶活力达到3360 U/ml,总蛋白含量达到4.30 g/L,且发酵过程中细胞活性一直保持在96%以上。结论:基因拷贝数与重组菌株的产酶水平呈正相关,摇瓶优化可显著提高重组菌株的产酶能力,为白地霉脂肪酶的工业化生产奠定了技术基础。
- 智晓燕汪小锋孙永川柯锋代敏闫云君
- 关键词：巴斯德毕赤酵母高密度发酵
- 膨润土催化脂肪酸甲酯合成二聚酸甲酯的工艺优化被引量：4
- 2010年
- 利用响应面方法优化膨润土催化脂肪酸甲酯合成二聚酸甲酯的工艺参数,得到最优参数为:催化剂加入量10%,催化助剂LiCl 0.8%,反应温度220℃,反应时间6 h。在最优条件下,二聚体收率为64.8%,产物的理化特性分析显示各项性能指标优良。
- 祝广山李琴刘云徐莉闫云君
- 关键词：生物柴油响应面法
- 带His-tag的解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2在毕赤酵母中的表达及纯化被引量：5
- 2011年
- 将去自身信号肽并且N-端带6×His标签的YlLip2基因克隆至表达载体pPIC9K中,电转化GS115获得高效表达脂肪酶His6-YlLip2的基因工程菌。筛选到的阳性克隆子摇瓶发酵脂肪酶活力最高为400U/ml。对重组毕赤酵母在10 L发酵罐中表达His6-YlLip2的分批补料发酵工艺进行了初步优化,探讨了培养基、pH、温度对生物量和重组蛋白表达量的影响。结果表明:采用FM22培养基,诱导温度为25℃,pH 5.0,甲醇诱导114 h后His6-YlLip2的最高酶活力达到3160U/ml。SDS-PAGE分析表明,蛋白的分子量大约为38kDa。重组的His6-YlLip2经镍柱一步纯化后的纯度达到95.43%,比酶活达到4250U/mg。
- 汪小锋申旭光赵鹤云孙永川纪昌涛闫云君
- 关键词：毕赤酵母解脂耶氏酵母组氨酸标签高密度发酵脂肪酶
- 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的基因改造及其在毕赤酵母中组成型和诱导型的表达被引量：10
- 2010年
- 【目的】克隆洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）脂肪酶基因,实现其在毕赤酵母中快速、安全和稳定性的大量表达。【方法】首先设计引物扩增B.cepacia脂肪酶基因,然后应用生物信息学方法分析B.cepacia和毕赤酵母整体密码子使用情况、脂肪酶基因信号肽及密码子偏好性。在此基础上,运用overlap PCR对脂肪酶基因中低使用频率密码子进行改造并同时降低基因的G＋C含量,获得优化的脂肪酶基因。再分别把原始和优化的脂肪酶基因导入载体pGAPZα和pPIC9K中,获得组成型表达载体pGAPlipW、pGAPlipO和诱导型表达载体pPIClipW、pPIClipO。分别将所得4种载体转入GS115中,得到一系列工程菌。经发酵和NTA树脂纯化后,对脂肪酶的酶学性质进行了初步研究。【结果】4种工程菌的脂肪酶活力分别为pPIClipW37.8U/mL,pPIClipO129.5U/mL,pGAPlipW40.2U/mL和pGAPlipO184.3U/mL。改造后脂肪酶活力比原始脂肪酶提高了4.6倍。酶学性质研究表明,脂肪酶在60℃时活力最高,在40℃-65℃范围内非常稳定;脂肪酶最适pH值为9.0,在pH6.0-pH10.0范围均表现很好的稳定性。【结论】通过overlap PCR改造后的脂肪酶显著提高了其在毕赤酵母中的表达效率,且GAP启动子比AOX1启动子更适合于B.cepacia脂肪酶的表达。大量表达的重组脂肪酶的性质与野生脂肪酶的性质相同,符合生产要求。
- 贾彬刘文山杨江科叶才伟徐莉闫云君
- 关键词：洋葱伯克霍尔德菌OVERLAPGAP启动子
- 解脂耶氏酵母脂肪酶基因lip1的克隆、密码子优化及功能表达被引量：8
- 2010年
- 【目的】克隆解脂耶氏酵母(Yarrawia lipolytica)脂肪酶基因lip1,并通过密码子优化,首次实现其在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的诱导型和组成型表达。【方法】通过PCR扩增Y.lipolytica脂肪酶基因lip1,根据P.pastoris密码子偏爱性,运用重叠延伸PCR合成改造后基因MLip1,将其分别克隆至诱导型分泌载体pPIC9K和新构建的组成型分泌载体pG AP9K上,电转至P.pastoris GS115中,G418抗性筛选得到高拷贝转化重组子,摇瓶发酵,以对硝基苯酚酯为底物检测脂肪酶水解活力,并对表达产物进行酶学性质分析。【结果】从Y.lipolytica中成功克隆了脂肪酶基因lip1(GenBank:Z50020),全长1461bp,编码486个氨基酸残基,无内含子,无信号肽;密码子优化后基因表达水平相对于出发基因有较大提高,且组成型表达优于诱导型;Lip1酶学性质分析表明,其最适底物为pNPB(C4),45℃下Tris-Hcl缓冲液pH8.5时最大水解酶活为8.07U/mL。【结论】Y.lipolytica脂肪酶基因lip1的克隆丰富了脂肪酶基因资源,其高效基因工程菌的构建为将来实现规模化生产奠定了技术基础。
- 张黎赵鹤云徐莉刘云闫云君
- 关键词：克隆密码子优化GAP启动子
