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干扰素γ诱导人肝癌细胞表达HLA-E逃避NK细胞杀伤被引量：2: 2009年; 目的探讨干扰素γ(IFN-γ)诱导人肝癌细胞表达非经典人类白细胞抗原HLA-E,及对NK细胞肿瘤杀伤的影响。方法用不同终浓度的IFN-γ分别体外持续诱导人肝癌细胞系(BEL-7402)72h。用细胞免疫组织化学、Western-blot、逆转录PCR和流式细胞技术,检测各组细胞HLA-E基因产物的表达及各组的NK细胞杀伤率。结果与空白对照相比,IFN-γ(浓度100～1000U/ml)诱导BEL-7402细胞表达HLA-E基因产物(抗原、mRNA和蛋白)明显增多(P<0.01),细胞表面HLA-E抗原相应增多(P<0.01)。细胞表达HLA-E基因的强弱与IFN-γ诱导浓度有关。高浓度IFN-γ(500～1000U/ml)诱导细胞HLA-E阳性率、表达强度高于低浓度诱导(100～400U/ml)。最适宜的IFN-γ浓度为500U/ml,高浓度组的NK细胞杀伤率更低(P<0.01)。结论高浓度IFN-γ(500～1000U/ml)诱导人肝癌细胞HLA-E基因高表达,通过非经典HLA-Ⅰ(HLA-E)途径逃避NK细胞免疫监视。; 方天翎李华李君刘安重陈规划; 关键词：细胞 HLA抗原

肝癌HLA-E基因的表达及对判断肝癌肝移植疗效的意义被引量：3: 2009年; 目的观察肝癌患者人类白细胞抗原-E（HLA-E）及相关抗原的表达,以及其对判断肝癌肝移植预后的可行性和价值.方法回顾性研究40例肝癌肝移植患者,检测HLA-ABC、HLA-E、抗原提呈辅助分子（β2-M、TAP）抗原在其原发灶和癌旁硬化组织中的表达,逆转录PCR法检测石蜡标本中HLA-E mRNA的表达,并将各抗原表达情况与肝移植的预后进行统计学分析.结果与癌旁组织相比,癌巢HLA-ABC表达增强12例（30%）,一致21例（52.5%）,相对下调7例（17.5%）.HLA-E抗原在癌旁组织中表达不明显,癌巢阳性表达（＋＋/＋）为29例（72.5%）,P＜0.01,肝癌标本可检测出HLA-E mRNA的表达.β2-M和TAP在癌巢和癌旁组织中均有相同程度的表达,无统计学意义.随访期内HLA-E（＋＋/＋）患者移植后无瘤生存期较短（P＜0.05）.结论肝癌HLA-E异常表达影响肝癌肝移植的疗效,提示其在肝癌免疫逃避中的重要作用.; 方天翎李华张彤曾宪成陈规划; 关键词：人类白细胞抗原-E 肝细胞癌肝移植

HLA-E siRNA沉默肝癌细胞HLA-E基因的表达被引量：3: 2010年; 目的针对HLA-EmRNA靶序列不同位点,设计合成多个siRNA链,定量分析其对HLA-E(+)肝癌BEL-7402细胞的基因沉默效率,筛选最佳抑制效果的siRNA。方法用IFN-γ(5×105IU·L-1)诱导BEL-7402细胞表达HLA-E基因,经流式细胞技术纯化后作为靶细胞。设计并合成3条HLA-E siRNA链(A、B、C),将各siRNA(0.1mmol·L-1)经脂质体Lipofectamin 2000转染至靶细胞。采用细胞免疫荧光、流式细胞技术、Western杂交、实时PCR等定量方法,比较48h后各siRNA的基因沉默效果,并观察HLA-E基因沉默对NK肿瘤细胞杀伤的影响。结果与空白对照、非特异组相比,3组(A、B、C组)HLA-E siRNA均明显抑制细胞HLA-E抗原、蛋白产物、mRNA、细胞表面HLA-E分子的表达(P<0.01),B、C组抑制效果接近90%,高于A组(P<0.01)。A、B、C组NK肿瘤杀伤率升高(P<0.01),而B、C组肿瘤杀伤效果高于A组(P<0.01)。结论经筛选的HLA-EsiRNA能特异、高效沉默肝癌细胞HLA-E基因表达,可能抑制其非经典HLA-Ⅰ途径免疫逃避,为肝癌"基因-免疫"治疗提供新的治疗策略。; 方天翎李华张彤曾宪成陈规划; 关键词：小分子干扰RNA HLA-E NK 靶向性

siRNA沉默肝癌细胞报告基因瞬时表达效应的定量分析被引量：4: 2007年; 目的研究小分子干扰RNA(siRNA)特异性抑制肝癌细胞基因瞬时表达的可行性和基因沉默效率。方法凝胶电泳成像观察siRNA体外孵育后的降解性,利用Cy3示踪观察其转染HepG2细胞后动力学变化。将报告基因(GFP)和siRNA共同瞬时转染至HepG2细胞,流式细胞仪、Western blot RT-PCR等分析特异性siRNA抑制报告基因瞬时表达的效应。结果siRNA在空白培养液中和转染细胞内可较长时间保持相对稳定。与空白和非特异siRNA相比,GFPsiR-NA明显抑制GFP蛋白产物和mRNA的表达(P<0·05)。结论特异性siRNA能高效沉默人肝癌细胞转染基因的瞬时表达,为基因治疗提供了一种新的治疗策略。; 方天翎陆敏强蔡常洁杨扬李华许赤陈规划; 关键词：小分子干扰RNA 肝细胞癌绿色荧光蛋白

HLA-E基因慢病毒载体构建及其在肝癌HepG2细胞中的表达被引量：1: 2008年; 目的构建表达人类白细胞抗原-E(HLA-E)基因慢病毒载体,探讨慢病毒介导HLA-E基因在肿瘤免疫中的意义。方法2006年10月至2007年11月在中山大学附属第三医院肝移植中心应用pGC-E1-GFP-HLA-E慢病毒载体转导肝癌HepG2细胞,检测慢病毒载体的转导效率、细胞内HLA-E信使核糖核酸(mRNA)及蛋白质水平的表达。结果pGC-E1-GFP-HLA-E慢病毒载体转导肝癌HepG2细胞72h的转导效率为(95.0±1.3)%;通过RT-PCR检测24h后细胞内HLA-E mRNA水平是肝癌HepG2细胞的(8.73±1.05)倍,72h后为(293.48±42.01)倍,差异具有统计学意义(P<0.01)。细胞免疫组化显示转导HLA-E后细胞内的蛋白水平明显增强。结论慢病毒载体系统能够使转导的基因在靶细胞中得到稳定表达,是基因治疗中的理想载体。; 张彤方天翎李华聂常富蔡常洁许赤汪根树李玺易慧敏姜楠陈规划; 关键词：慢病毒人类白细胞抗原-E 基因表达

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中国博士后科学基金(20060390753)