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慢病毒介导的小RNA干扰组织蛋白酶B转染小鼠脑微血管内皮细胞的条件: 2012年; 目的研究慢病毒介导下小RNA干扰组织蛋白酶B转染小鼠脑微血管内皮细胞（bEND．3）的最佳条件。方法实验分3组，完全培养基组（NP组）、培养基＋5mg／L凝聚胺组（P1组）和培养基＋8mg／L凝聚胺组（P2组），每组均有5个不同梯度的转染复数（MOI），即1、5、10、15、20，每个MOI值设3个孔，共45组。转染48、72、96h分别在荧光显微镜下计数绿色荧光蛋白，并求其转染率，从而得到其最佳MOI值；1周后采用MTr法检测最佳MOI值对bEND．3活性和存活率的影响。结果转染48h时，在各组观察到少量绿色荧光蛋白，其转染率介于1％～9％；72h和96h时，MOI相同的各组问差异无统计学意义（P〉0．01），其中，MOI为1、5、15的各组转染率均低于20％；MOI为10和20组，转染率介于71％～97％与60％～84％，且MOI为10组转染率高于MOI为20组，差异有统计学意义（P〈0．01）。M1rr检测Pl组和P2组存活率，l周时分别为（81．38±6。69）％、（62．03±5．13）％，Pl组显著高于P2组（t=15．795，P〈0．001）。结论慢病毒介导的小RNA干扰组织蛋白酶B转染bEND．3最佳优化条件为MOI=10，凝聚胺为5mg／L，最佳转染时间为转染后72h。; 周国宏孔丽; 关键词：慢病毒组织蛋白酶B 小鼠脑微血管内皮细胞转染率

组织蛋白酶B-RNAi-慢病毒对体外类毛细血管形成的抑制被引量：1: 2012年; 目的探讨组织蛋白酶β-RNAi-慢病毒CathepsinB-RNAi-Lentivirus(CTSB-RNAi-LV)对体外类毛细血管形成的抑制作用。方法实验分为对照组和RNAi慢病毒组,采用免疫组织化学和构建体外类毛细血管模型的方法,检测CTSB-RNAi-LV转染小鼠脑微血管内皮细胞(mouse brain micvascular endothelial cells,bEND.3)后对Cathepsin B和类毛细血管形成的影响。结果免疫组织化学结果显示,bEND.3内Cathepsin B的表达呈棕褐色,主要位于细胞核周围,各组间Cathepsin B的表达以RNAi慢病毒组最少;bEND.3和培养基总蛋白测定与体外类毛细血管形成实验表明:RNAi慢病毒组总蛋白的含量和体外类毛细血管的形成区域明显低于其余两组,其组间比较有统计学意义(P<0.05)。结论CTSB-RNAi-LV能抑制bEND.3内Cathepsin B的表达和体外类毛细血管区域的形成。CTSB-RNAi-LV可靶向抑制体外类毛细血管的形成。; 孔丽周国宏; 关键词：组织蛋白酶B 小鼠脑微血管内皮细胞免疫组织化学

Cathepsin B-RNAi-lentivirus新生血管形成的研究抑制小鼠视网膜被引量：3: 2013年; 背景视网膜新生血管性疾病是一种严重影响视力的眼病.研究表明,cathepsin B参与新生血管的生成,寻找抑制视网膜新生血管形成的药物可为此类疾病的分子机制研究提供依据. 目的研究cathepsin B-RNAi-lentivirus对小鼠视网膜新生血管的抑制作用. 方法将7日龄清洁级C57BL/6J小鼠与其母鼠共同置于氧体积分数为（75±2）％的密闭氧箱内5d,制作视网膜新生血管模型,5d后返回正常环境.应用随机数字表法将60只小鼠随机分为模型对照组、阴性对照组和基因治疗组,每组20只.模型对照组小鼠不给予任何药物干预,阴性对照组小鼠玻璃体腔内注射空载体与辅助载体包装成的无目的基因的空病毒颗粒（NC-GFP-LV）1 μl,基因治疗组以同样的方法注射eathepsin B-RNAi-lentivirus 1μl.注射5d后各组分别应用随机数字表法随机处死7只小鼠,获取14只眼的视网膜,采用real-time PCR法检测小鼠视网膜中cathepsin BmRNA的表达量（2△△Ct）,另外同时间点同法分别处死8只小鼠,获取16只眼球的视网膜,采用Western blot法检测各组小鼠视网膜中cathepsin B蛋白的相对表达量（cathepsin B/β-actin）.注射5d后各组分别取剩余5只小鼠行异硫氰酸葡聚醛荧光素（FITC-dextran）心脏灌注,并处死动物,制备10只眼的视网膜铺片,荧光显微镜下观察和比较各组小鼠视网膜新生血管的形态和数量. 结果基因治疗组小鼠视网膜中cathepsin B mRNA的表达水平（2-△△Ct）为0.740.12,明显低于模型对照组及阴性对照组的1.66±0.17和1.58±0.29,差异均有统计学意义（q=0.746、1.588,P＜0.01）.基因治疗组小鼠视网膜中cathepsin B蛋白的表达水平（cathepsin B/β-actin）为0.64±0.06,明显低于模型对照组及阴性对照组的0.93±0.09和0.96±0.09,差异均有统计学意义（q=0.637、0.894,P＜0.01）.小鼠视网膜荧光染色结果显示,模型对照组和阴性对照组小鼠视网膜新生血管分层及�; 周国宏孔丽; 关键词：组织蛋白酶B 新生血管

组织蛋白酶B-RNAi-LV载体构建及其对小鼠脑微血管内皮细胞系bEND.3的影响被引量：4: 2011年; 目的构建组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)小RNA(siRNA)慢病毒载体,并探讨其对小鼠脑微血管内皮细胞(bEND.3)的影响。方法设计并合成含有干扰Cathesin B基因的19 nt的双链寡DNA片段,将此片段克隆到携有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒表达载体质粒pGCSIL-GFP上,经测序正确后,命名为pGCSIL-GFP-CTSB,将慢病毒表达载体pGCSIL-GFP-CTSB、慢病毒包装载体pHelper1.0和pHelper2.0 3质粒共同转染于293T细胞,获得携带Cathepsin B基因的RNAi慢病毒(Cathesin B-RNAi-Lentivirus,即CTSB-RNAi-LV),通过Real time-PCR和Western blotting方法观察CTSB-RNAi-LV对bEND.3的影响。结果 1.pGCSIL-GFP-CTSB中携带有正确的Cathesin B siRNA基因;2.目的基因Cathepsin B siRNA被RNAi慢病毒高效地转导入靶细胞bEND.3内,并达到稳定的表达;3.CTSB-RNAi-LV能有效降低bEND.3中Cathepsin B mRNA和蛋白表达。结论成功构建了RNAi慢病毒载体pGCSIL-GFP-CTSB;并成功包装了RNAi慢病毒CTSB-RNAi-LV;CTSB-RNAi-LV能有效地抑制bEND.3中Cathepsin B mRNA和蛋白表达水平下调。; 孔丽周国宏杨桂姣和荣丽; 关键词：组织蛋白酶B 293T细胞内皮细胞免疫印迹法小鼠

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山西省自然科学基金(2009011056-3)

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