福建省自然科学基金(2012J01123)
- 作品数：8 被引量：17H指数：3
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- 苏云金芽孢杆菌aiiA基因在枯草芽孢杆菌中的表达被引量：4
- 2013年
- 根据NCBI上已公布的枯草芽孢杆菌BS168菌株的β-1,4-glucanase(eglS)基因以及苏云金芽孢杆菌的aiiA基因序列,设计引物并扩增得到eglS基因的启动子、信号肽序列和aiiA基因.构建重组表达载体Ps4-eaiiA,转化枯草芽孢杆菌BS168,得到枯草芽孢杆菌工程菌BS168/Ps4-eaiiA.该工程菌诱导发酵后经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:aiiA基因实现了在枯草芽孢杆菌中的表达.对胡萝卜软腐欧文氏菌进行马铃薯的抗病性实验,结果表明aiiA基因在枯草芽孢杆菌中表达的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏杆菌表现出一定的抗病性.
- 曾世涌温真何海滔杨彩云毛惠民杨梅
- 关键词：苏云金芽胞杆菌
- N-酰基高丝氨酸内酯酶AiiA的分子改造及酶学特性
- 2014年
- 革兰氏阴性细菌的群体感应系统利用N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone,AHL)作为主要信号分子诱导致病因子表达,造成细菌性病害.N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase,AHLase)能水解AHL分子的内酯键,减弱致病菌的危害.本研究利用从苏云金芽孢杆菌克隆的N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(auto inducer inactivation A,aiiA),根据Swiss-model模拟aiiA所编码的AiiA蛋白三维结构,预测可能形成的分子内盐桥、活性中心位点等,利用环状诱变方法对AiiA进行定点突变,以期提高其酶活力和热稳定性等酶学性能.对AiiA及其突变蛋白酶学特性分析结果发现,突变体AiiA-N65K-A206E酶活力要比野生型AiiA-wild提高87.4%,并表现出良好的热稳定性和储存稳定性;37℃温浴30 min后酶活力剩余73.9%,比AiiA-wild有了大幅提高;4℃储存120 h后酶活力剩余12.9%,而AiiA-wild丧失酶活力.酶动力学分析表明,AiiA-N65KA206E酶促反应的米氏常数Km为1.23 mmol/L,与野生型相当;最大反应速率Vmax为32.36μmol/L/min,比野生型有较大提高.本研究表明,利用定点突变技术改造AiiA的分子结构,可有效提升AiiA酶活力、热稳定性和储存稳定性.本研究结果为进一步阐明AiiA结构与功能的关系,促进AiiA在植物病害生物防治上的应用,提供了有益的参考和新的思路.
- 杨梅简思美杨彩云谢盼盼曾世涌
- 关键词：定点突变酶学特性
- 苏云金芽孢杆菌aiiA基因在毕赤酵母中的分泌表达被引量：2
- 2012年
- 根据GenBank中aiiA基因设计引物,以苏云金芽孢杆菌基因组为模板扩增出aiiA基因后构建出pPIC9K-aiiA重组表达载体,线性化后转化毕赤酵母GS115,获得重组工程菌GS115/pPIC9K-aiiA,以体积分数为1%的甲醇进行诱导表达.表达产物经SDS-PAGE及Western blotting分析显示表达的蛋白具有较好的免疫特异性.抗病性实验显示表达的目的蛋白具有生物学活性和良好的抗病能力.
- 毛惠民林丽玉杨彩云温真曾世涌杨梅
- 关键词：AIIA基因PPIC9K分泌表达
- 定点突变提高N-酰基高丝氨酸内酯酶酶活和温度稳定性被引量：3
- 2014年
- 【目的】提高N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine lactonase,AiiA)酶活及温度稳定性。【方法】本研究基于AiiA同源蛋白的三维结构对AiiA进行定点突变,分析野生型AiiA及其突变蛋白酶活和温度稳定性。【结果】野生型AiiA较不稳定,在45℃下温浴30 min,或4℃储存5 d后均失去降解N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL)的活性。但是突变AiiA蛋白(N65K,T195R和A206E)的酶活力较野生型AiiA均提高了20%以上,且4℃储存时间延长到7 d。此外,突变株N65K比野生型AiiA对高温具有更强的耐受性,在45℃温浴后剩余酶活力达到45%以上,55℃温浴30 min后仍保留5.0%的酶活力。【结论】通过定点突变改造AiiA蛋白结构,提升了AiiA蛋白的酶活和温度稳定性。
- 杨梅谢盼盼简思美林丽玉杨彩云
- 关键词：N-酰基高丝氨酸内酯酶学特性定点突变
- 重组毕赤酵母AiiA蛋白表达量的双抗体夹心ELISA测定被引量：1
- 2014年
- 利用双抗体夹心ELISA的方法，建立了能对重组毕赤酵母表达AiiA蛋白进行定量测定的方法．双抗体夹心ELISA方法建立的标准AiiA蛋白曲线显示，随着AiiA蛋白质量浓度增大，显色后A410值增大，在AiiA质量浓度为1．11—35．5μg·mL-1的范围内具有良好的线性关系．经方法学分析表明，该方法对合有AiiA蛋白的发酵样品的检测具有良好的特畀性和精确度，AiiA的检测限为0．80μg·mL-1，批内差畀系数和批间差异系数分别为5．22％和10．30％．测定8．86，2．22，1．11μg·mL-13个质量浓度回收率分别为104％、97．3％和102％，能够满足定量要求．
- 曾世涌简思美谢盼盼杨梅
- 关键词：双抗体夹心法
- 基因改造AiiA蛋白在毕赤酵母中的表达被引量：6
- 2015年
- 基于毕赤酵母基因组偏好密码子数据表对编码Aii A蛋白的碱基序列进行密码子优化,并构建多拷贝重组Oaii A表达载体p PICZαB-x Oaii A(x=1,2,3),成功表达出具有活性的Aii A蛋白.实验结果表明,优化后Oaii A基因的表达量(2.64 mg·L-1)较优化前aii A的表达量(1.38 mg·L-1)提高约两倍.优化后二拷贝和三拷贝表达量分别为2.84 mg·L-1和2.93 mg·L-1.结果表明密码子优化可以有效提高Aii A蛋白在毕赤酵母中的表达,但是多拷贝表达载体对Aii A的表达促进作用并不显著.提示未来在探索Aii A蛋白在毕赤酵母中的高表达时,通过增加拷贝数来提高产量并不是一个很好的途径,而进行密码子的优化可以有效提高产量.
- 简思美蔡斌斌吴程何晶晶曾世涌杨梅
- 关键词：密码子优化多拷贝毕赤酵母
- 苏云金芽胞杆菌中aiiA基因密码子偏好性分析被引量：6
- 2013年
- aiiA基因指导表达的AiiA蛋白是一类能水解细菌群体感应信号分子内酯键的内酯酶。本研究使用CodonW、CUSP和CHIPS等相关程序对苏云金芽胞杆菌中aiiA基因的密码子使用情况进行分析,比较了aiiA基因与大肠杆菌、苏云金芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌以及毕赤酵母的密码子偏好性。结果表明,aiiA基因偏好使用以A、T结尾的密码子;aiiA基因的密码子用法与大肠杆菌、苏云金芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和毕赤酵母的基因组密码子用法都有不同程度的偏好差异,其中与毕赤酵母的密码子用法差异最大;比较了aiiA基因分别以苏云金芽胞杆菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌及毕赤酵母为宿主时密码子使用频率,发现都含有不同程度的低频密码子聚集现象,如果要在上述几种表达系统中实现aiiA基因的高效表达则需对aiiA基因的部分密码子进行优化改造。
- 曾世涌苏小惠谢盼盼毛惠民杨梅
- 关键词：苏云金芽胞杆菌AIIA基因密码子偏好性密码子优化异源表达
