江苏省产学研联合创新资金项目(SBY201320109)
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
- 相关作者：李庆平高波陈才宋成义钱跃更多>>
- 相关机构：扬州大学更多>>
- 发文基金：江苏省产学研联合创新资金项目国家自然科学基金中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 多转座子载体的构建及转座特性比较研究
- 2015年
- 【目的】转座子(transposon,Tn)是染色体上可自主复制和移位的基本单位,普遍存在生物体基因组内,Sleeping beauty(SB)、piggy Bac(PB)和Tol2分别来源于鲑鱼、甘蓝尺蠖蛾和青鳉鱼,是目前脊椎动物中活性较高的转座子。比较了这3种转座子在哺乳动物细胞的转染、插入和剪切效率,从而获得细胞水平上的高活性转座子系统。【方法】通过高保真PCR法分别从SB、PB和Tol23种转座子载体克隆3种转座子3′和5′端的转座元件,测序正确后,将各转座元件依次亚克隆至p T2-HB载体框架,构建成包含这3种转座子的多转座子载体pT3-PST。将绿色荧光蛋白表达框CAG-GFP和新霉素表达框PGK-NEO分别克隆至p T3-PST载体,获得两个表达载体pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。将这两个表达载体分别和转座酶表达质粒pCMV-SB100X、p CMV-HAhy PBase、p CMV-Tol2以1﹕1质量比混合,经多聚阳离子PEI包裹,共转染小鼠胚胎成纤维细胞(3T3),同时以突变失活的转座酶质粒SB△DD与转座子载体共转染作为阴性对照组。转染GFP 36 h后,用荧光显微镜进行检测GFP表达率,提取细胞基因组,以Amp基因作为内参,进行实时荧光定量PCR,检测GFP插入拷贝数;根据被剪切位置上下游序列设计引物,进行实时荧光定量PCR,检测3种转座子的剪切效率。细胞转染NEO 48 h后,用浓度为500μg·m L-1的G418进行耐药性筛选,至正常细胞基本全部死亡(10 d),将细胞进行吉姆萨染液染色,统计耐药细胞数,从而比较各组转座活性。【结果】成功构建了多转座子载体PT3-PST、pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。实验组转染细胞效率均大于50%,且差异不显著(P>0.05)。SB组GFP相对拷贝数高于Tol2和PB组,但差异不显著(P>0.05),均显著高于对照组(P<0.05)。SB和PB组剪切效率显著高于Tol2组(P<0.05),但SB和PB组之间差异不显著(P>0.05)。pT3-PGK-NEO与转座酶共转染3T3细胞,G418抗性筛选结果表明,SB组耐药细胞数显著高于P
- 沈丹谢雨琇李庆平薛松磊史云强王赛赛陈才钱跃高波崔恒宓宋成义
- 关键词：胚胎成纤维细胞
