福建省医学创新课题(2007-CX-14)
- 作品数：4 被引量：12H指数：2
- 相关作者：许昌声谢良地朱鹏立余惠珍王华军更多>>
- 相关机构：福建医科大学福建省立医院深圳市人民医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人组织激肽释放酶基因重组腺病毒转染对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响被引量：2
- 2010年
- 目的:探讨重组腺病毒介导的人组织激肽释放酶(hKLK1)基因转移对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导下的自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMCSHR)增殖和迁移的影响。方法:自行构建双顺反子重组腺病毒载体,携带强绿色荧光蛋白(EGFP)标志基因和目的基因hKLK1;用细胞计数法和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞生长周期;蛋白免疫印迹法(Western blotting)测定细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27Kip1、p21Cip1的表达。采用改良Boyden微孔膜双槽法测定VSMCSHR迁移。结果:(1)hKLK1基因转移呈感染复数依赖性(20-100MOI)抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR生长,100MOI时抑制率为39.3%;呈时间依赖性抑制VSMCSHR生长,第5d时达高峰,抑制率为35.2%。(2)hKLK1基因转移可显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR增殖,峰值抑制率为30.2%(P<0.01);细胞周期阻滞于G0/G1期的VSMCSHR明显增多,最大阻滞率为36.4%(P<0.01),而缓激肽B2受体特异性阻断剂Hoe140逆转了hKLK的抑制作用。(3)hKLK1基因转移明显上调PDGF-BB诱导VSMCSHR的p27Kip1、p21Cip1表达,Hoe140明显降低p27Kip1、p21Cip1表达。(4)hKLK1基因转移可明显抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR细胞迁移,抑制率为34.6%,且Hoe140不影响该抑制作用。结论:hKLK1基因转移可抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR增殖,主要由缓激肽B2受体介导的,通过上调细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27Kip1、p21Cip1表达的途径。而hKLK1基因转移抑制VSMCSHR迁移效应可能不通过B2受体。
- 谢良地余惠珍朱鹏立许昌声王华军李体远
- 关键词：基因转移血管平滑肌细胞
- 人组织激肽释放酶基因转移对血管平滑肌细胞迁移的影响被引量：2
- 2010年
- 目的探讨重组腺病毒介导的人激肽释放酶(hKLK1)基因转移对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导下的自发性高血压大鼠(SHR)的血管平滑肌细胞(VSMCSHR)迁移的影响。方法自行构建携带目的基因hKLK1和强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的双顺反子重组腺病毒载体。采用组织贴块法培养SHR胸主动脉血管平滑肌细胞,接种第3～6代VSMCSHR于6孔板,分别加入含hKLK1重组腺病毒和对照病毒干预,3d后加入PDGF-BB诱导24h,采用改良Boyden微孔膜双槽法测定VSMCSHR迁移,并加入缓激肽受体B2特异性阻断剂Hoe140。RT-PCR法测定缓激肽B1受体、B2受体的mRNA表达。结果hKLK1基因转移可明显抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR细胞迁移,抑制率为34.6%,且Hoe140干预不产生影响。PDGF-BB诱导的VSMCSHR缓激肽B2受体mRNA表达明显增加(P<0.001),而Hoe140可明显降低其表达(P<0.01)。结论重组腺病毒介导的hKLK1基因转移可抑制PDGF-BB诱导的VSMCSHR迁移,这一效应可能不通过B2受体途径介导。
- 余惠珍谢良地朱鹏立许昌声
- 关键词：基因转移血管平滑肌细胞细胞迁移缓激肽受体
- 人组织激肽释放酶基因转移对球囊拉伤后大鼠颈总动脉内膜的影响被引量：4
- 2010年
- 目的探讨重组腺病毒介导的人组织激肽释放酶1（Ad-hKLK1）基因转移对球囊拉伤后的自发性高血压大鼠（SHR）颈动脉新生内膜增生的影响及其机制。方法取SHR，雄性，采用球囊拉伤法建立大鼠颈动脉再狭窄模型，将存活动物随机分为4组，即假手术组（n=6）、单纯拉伤组（n=8）、拉伤＋注射对照病毒组（n=8）、拉伤＋注射Ad-hKLK1病毒组（n=8）。4周后处死大鼠，测定各实验组再狭窄动脉内膜形态学相关指标。RT-PCR法检测缓激肽受体（B1R和B2R）表达，蛋白免疫印迹法检测细胞周期素激酶抑制蛋白p27Kip1、p21Cip1的表达。结果拉伤＋Ad-hKLK1组大鼠颈总动脉的壁腔面积比W／L明显低于单纯拉伤组（1．056±0．149比1．641±0．194，P〈0．001），抑制率达35．6％，内膜／中膜面积比值显著小于单纯拉伤组（0．77±0．09比1．26±0．051，P〈0．01），抑制率达38．8％（P〈0．001）。拉伤＋Ad-hKLK1组的周期抑制蛋白p27Kip1和p21Cip1表达明显高于单纯拉伤组（0．55±0．05比0．31±0．06，P〈0．001和0．47±0．06比0．26±0．05，P〈0．001）。球囊拉伤后颈动脉的缓激肽B2R的mRNA表达明显高于假手术组（P〈0．01），而各组间的缓激肽B1R的mRNA表达差异无统计学意义。结论hKLK1基因转移可减轻SHR颈动脉球囊损伤后的新生血管内膜形成，注射外源性人组织激肽释放酶基因可上调缓激肽B2RmRNA表达和p27Kip1、p21Cip1的蛋白表达。
- 余惠珍谢良地朱鹏立许昌声王华军李体远
- 关键词：血管内膜
- 人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达被引量：6
- 2008年
- 目的:构建携EGFP为报告基因和人组织激肽释放酶1(hKLK1)基因双顺反子的重组腺病毒(Ad-hKLK1-IRES-EGFP),并观察在自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达变化。方法:通过双酶切质粒pBluescritII KS-hKLK1,将hKLK1基因定向克隆至带有IRES-EGFP的腺病毒穿梭质粒pDC316中,构建成重组穿梭质粒,将其与腺病毒骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染293A细胞,经包装并获得重组腺病毒,用PCR、酶切及测序方法对其进行鉴定,测定病毒滴度;用重组腺病毒感染VSMCs,用荧光显微镜下观察到的绿色荧光来测定感染率,用RT-PCR和Western blotting法测定hKLK1基因在VSMCs中的表达。结果:PCR、酶切和测序表明携EGFP的重组穿梭质粒pDC316-hKLK1-IRES-EGFP构建正确,并与骨架质粒在293A细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-hKLK1-IRES-EGFP,其滴度为4.5×1011/L。重组腺病毒感染VSMCs后,在荧光显微镜下观察到明亮绿色荧光蛋白表达,感染率高达90%以上,可检测到hKLK1基因的mRNA及蛋白表达,并与感染时间(1 d-7 d)有显著依赖关系,峰值感染复数为100 MOI。结论:成功构建并包装了携EGFP和hKLK1基因的双顺反子重组腺病毒载体系统Ad-hKLK1-IRES-EGFP;感染VSMCs可检测到基因hKLK1和EGFP的独立共同高表达,该系统为一直观、安全、高效的基因转移系统。
- 余惠珍谢良地朱鹏立许昌声王华军李体远
- 关键词：人组织激肽释放酶重组腺病毒载体血管平滑肌细胞绿色荧光蛋白
