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上海市科学技术委员会资助项目(06ZR14092)
作品数:
2
被引量:12
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胡忠义
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SELEX技术筛选结核分枝杆菌MPT64蛋白DNA适配子方法学研究
被引量:2
2008年
目的利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选能与结核分枝杆菌MPT64蛋白特异结合的寡核苷酸适配子。方法体外合成长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库,利用sELEX技术筛选,以MPT64蛋白为靶物质进行12轮筛选,利用生物素-亲和素显色系统检测寡核苷酸与蛋白的结合性。结果SELEX技术筛选MPT64蛋白适配子的技术体系:PCR扩增的最佳退火温度为65℃;文库优化时,最佳Mg^2+的浓度为1.5mmol/L;不对称PCR法制备ssDNA时,Mg^2+的浓度为0.75mmol/L;以酶联板为介质筛选时,在10轮后筛选达到饱和,且随着筛选轮数的增加,PCR扩增产物的电泳条带逐渐单一、致密,亲和性检测显示第10轮获得的适配子库,比初始的文库亲和性吸光度(A)值增加了9.18倍。将适配子库克隆,随机挑取10个单克隆子,利用混合夹心法检测其与MPT64的亲和性,亲和性范围分布在0.572—1.606之间。结论已初步筛选到与MPT64蛋白高亲和性结合的DNA适配子。
秦莲花
郑瑞娟
杨华
冯永红
王洁
胡忠义
关键词:
结核分枝杆菌
SELEX
亲和性
结核分枝杆菌MPT64蛋白适配子的筛选与鉴定
被引量:10
2008年
目的利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选能与结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64特异性结合的寡核苷酸适配子,寻找早期诊断结核病的方法。方法体外合成随机单链DNA(ssDNA)文库,以MPT64蛋白为靶物质,采取SELEX技术进行12轮筛选,将适配子库克隆、测序后,用DNAMAN软件对其结构进行分析,经生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力,并利用捕获适配子与检测适配子组成的“三明治”夹心法对获得的适配子进行初步验证。将13个非结核分枝杆菌菌株和BCG菌株作为阴性组计为0,将结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌组作为阳性组计为1,采用MedCalc软件分析受试者操作特征曲线,确定最佳阳性判定值,并构建散点图。结果经12轮筛选后,随机挑选15个适配子与MPT64蛋白的亲和性进行分析,吸光度值为0.492—1.243,73.3%的适配子的吸光度值在1.0以上;二级结构分析显示,适配子与MPT64蛋白亲和性的基础主要是大口袋茎环结构,口袋与环之间的茎桥含有不同数量的GC碱基对;“三明治”夹心法对阴性组[非结核分枝杆菌标准菌株及卡介苗(BCG)株]和阳性组(结核分枝杆菌实验室H37Rv株及临床株、牛结核分枝杆菌标准株)共47个菌株培养上清的检测结果显示,在临界(cut-off)值为0.61时,H37Rv、牛结核分枝杆菌组为阳性,BCG株为阴性;阴性组标本的阴性检出率为85.7%,阳性组标本的阳性检出率为87.9%,表现出一定的检测价值。结论已初步筛选到与MPT64蛋白具有高亲和性的DNA适配子。
秦莲花
马占忠
郑瑞娟
刘忠华
陆俊梅
胡忠义
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