国家自然科学基金(30271190)
- 作品数：9 被引量：19H指数：3
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- 相关机构：浙江大学医学院附属邵逸夫医院实验动物中心浙江大学医学院附属第二医院更多>>
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- 含HPV16 E7的病毒样颗粒诱导小鼠产生特异性CTL反应被引量：1
- 2005年
- 目的探讨含BPVL1/HPV16E7嵌合型乳头瘤病毒样颗粒(VLPs)在动物小鼠体内的免疫学特性。方法将HPV16E7基因分为(a)、(b)、(c)3段,与BPVL1连接后表达的BPVL1/HPV16E7(a)、(b)、(c)嵌合型VLP分别免疫小鼠C57BL/6J,对其淋巴结淋巴细胞进行细胞毒性T淋巴细胞反应(CTL)分析。结果接受嵌合型VLPBPVL1/HPV16E7(b)免疫的小鼠淋巴结淋巴细胞可以引发很强的对C-2细胞(HPV16E7aa47-59转染的EL-4细胞)的特异性CTL反应,但不能对EL-4细胞产生细胞毒性作用。结论含BPVL1/HPV16E7嵌合型VLP作为抗原输送系统致敏小鼠T淋巴细胞并引发抗原特异性CTL反应,可能为HPV疫苗的设计提供一个新手段。
- 程浩叶俊周健
- 关键词：特异性CTL反应病毒样颗粒EL-4细胞HPV16E7T淋巴细胞反应基因分
- 不同引物介导的聚合酶链反应对人乳头瘤病毒的快速检测与分型被引量：5
- 2007年
- 目的 比较通用引物、型特异性引物在检测人乳头瘤病毒（HPV）DNA中的应用。方法 104例尖锐湿疣组织中提取DNA后分别用HPV6b、11、16、18型特异性引物及通用引物MY09／11、GP5^＋／6^＋经聚合酶链反应（PCR）进行扩增。部分标本采用限制性内切酶Pst I来确定HPV11型。结果 GP5^＋／6^＋的检出率高于MY09／11，但差异无显著性（χ^2=3．78，P〉0．05）。GP5^＋／6^＋检出微量HPV DNA的敏感度高于MY09／11。型特异性引物检测HPV感染优于通用引物MY09／11结合酶切分型。结论 型特异性引物检出HPV11单一型感染显著多于HPV6b型，且发现HPV6b、11型同时感染有逐年增高之趋势。GP5^＋／6^＋引物结合型特异性引物可为临床上检测尖锐湿疣HPV型别提供方便易行的选择。
- 金纳姚晓红赵可佳王也玲程浩
- 关键词：人乳头瘤病毒聚合酶链反应
- 尖锐湿疣病损组织粗提蛋白对混合淋巴细胞反应的影响被引量：2
- 2005年
- 目的 通过观察尖锐湿疣病损组织粗提蛋白刺激后的树突状细胞(DC)对混合淋巴细胞反应的影响,探讨尖锐湿疣病损粗提蛋白对DC免疫功能的影响。方法 用聚合酶联反应(PCR)鉴定尖锐湿疣病损组织中人乳头瘤病毒(HPV)6 DNA和HPV11 DNA。人脐带血和外周血分离培养10 d的DC分别用尖锐湿疣病损组织和健康儿童包皮组织粗提蛋白刺激2次。另设空白对照组磷酸盐缓冲液(PBS)刺激。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测DC刺激同种异体和自体混合淋巴细胞反应的能力。同种异体淋巴细胞来源于脐带血和外周血,同种自体淋巴细胞来源于外周血。结果 PCR结果显示尖锐湿疣病损组织中HPV6b DNA阳性。尖锐湿疣病损粗提蛋白刺激后的DC刺激来源于脐血的T淋巴细胞,其增殖指数(5.514)高于包皮对照组(2.645)和空白对照组(1.698,DC∶T均为1∶11)。尖锐湿疣病损粗提蛋白刺激后的DC刺激来源于外周血的T淋巴细胞的增殖指数(2.352)高于包皮对照组(1.083)和空白对照组(0.644,DC∶T均为1∶3)。结论 尖锐湿疣病损粗提蛋白可能因存在的HPV病毒抗原对DC的刺激和功能活化,进一步促进了T淋巴细胞的增殖活化,并进而推测可以提高机体抗病毒特异性细胞免疫。
- 芦桂青程浩张行沈建根岑建萍叶俊
- 关键词：尖锐湿疣DC混合淋巴细胞反应外周血T淋巴细胞
- 钙网蛋白基因120片段和人乳头瘤病毒6bE7基因诱导的小鼠细胞免疫反应
- 2005年
- 目的研究嵌合DNA疫苗钙网蛋白基因120片段(CRT120)和人乳头瘤病毒6b型E7基因(HPV6bE7)的免疫学特性。方法克隆、构建重组质粒即嵌合DNA疫苗pcDNA3．1-GFP-CRT120／ HPV6bE7、pcDNA3．1-GFP-HPV6bE7、pcDNA3．1-GFP-CRT120;经脂质体转染获得HPV6bE7转染阳性 B16细胞株;用肌内注射法对C57BL/6小鼠进行重组质粒DNA疫苗免疫;检测免疫小鼠的外周血T淋巴细胞亚群变化、小鼠脾细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性以及与靶细胞共孵育后白介素2和干扰素γ的分泌水平。结果获得构建正确的嵌合DNA疫苗pcDNA3．1-GFP-CRT120／HPV6bE7以及稳定表达HPV6bE7 的阳性细胞株。CRT120／HPV6bE7较之HPV6bE7能引起免疫小鼠外周血中CD8+T淋巴细胞亚群分化和 TCRγδ T细胞上调(P<0．05),脾淋巴细胞与靶细胞共孵育上清液中白介素2和干扰素γ的浓度也明显高于HPV6bE7和CRT120组(P<0．05);CRT120／HPV6bE7免疫的小鼠淋巴细胞对靶细胞B16／HPV6bE7 有明显的杀伤活性。结论 CRT120／HPV6bE7嵌合DNA疫苗能够诱导免疫小鼠的病毒抗原特异性细胞免疫。
- 徐妍程浩赵可佳叶俊张行宋韬陈民利王琦
- 关键词：钙网蛋白
- HPV6b型E7基因与CRT基因真核融合表达质粒的构建
- 2004年
- 目的 采用HPV 6bE7基因与钙网蛋白 (Calreticulin ,CRT)基因共连接方法 ,构建高特异性、能更加活化细胞免疫的HPVDNA疫苗。方法 利用PCR技术分别获得HPV6bE7基因和CRT基因片段 ,与带GFP标记的真核表达质粒pCDNA 3.1+共连接。结果 获得阳性重组表达质粒pCDNA 3.1+ GFP HPV6bE7/CRT 180 ,经酶切鉴定及核酸序列测定证明真核融合表达质粒构建完成。结论 HPV 6b型E7基因与CRT基因真核融合表达质粒的成功构建为下一步建立高特异性、高效HPVDNA疫苗的研究打下基础。
- 宋韬叶俊程浩赵可佳
- 关键词：人类乳头瘤病毒真核表达质粒钙网蛋白
- 表达人乳头瘤病毒6b和11型E6/E7基因的小鼠肿瘤细胞株的建立被引量：6
- 2004年
- 目的构建含有人乳头瘤病毒(HPV)6b和11型E6/E7基因的表达质粒和建立这些基因的转染细胞株。方法分别将HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7克隆于含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.1,经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性克隆,荧光显微镜观察,RT-PCR鉴定mRNA转录。结果通过酶切鉴定和基因测序证实,构建质粒中目的基因片段序列完全正确。转染后荧光显微镜下可观测到B16细胞发出绿色荧光。以G418筛选的抗性细胞克隆提取RNA并经RT-PCR扩增出与目的基因大小一致的基因片段。结论建立的小鼠肿瘤细胞B16表达HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7基因。提示转染的细胞株可移植于小鼠,利于体内研究这些基因的生物学作用和免疫学机制。
- 赵可佳程浩陈民利丁志山耿礼义方永明
- 关键词：人乳头瘤病毒11型E6基因E7基因小鼠基因转染
- 尖锐湿疣皮损组织粗提蛋白对DC分泌IL-12和淋巴细胞分泌IFN-γ的影响被引量：1
- 2008年
- 目的探讨尖锐湿疣(CA)皮损组织粗提蛋白对树突状细胞(DC)分泌IL-12水平及对淋巴细胞分泌IFN-γ水平的影响。方法将体外诱导培养的DC分别以细菌脂多糖(LPS)、CA粗提蛋白、包皮粗提蛋白和PBS溶液刺激,孵育2～14天,ELISA法分别检测上清液中IL-12和IFN-γ的水平。结果LPS组IL-12和IFN-γ表达水平分别为(262.0±18.5)pg/mL和(494.3±48.8)pg/mL,CA组分别为(146.0±38.0)pg/mL和(392.0±39.7)pg/mL,包皮组分别为(12.0±5.2)pg/mL和0 pg/mL,PBS组为(10.7±6.43)pg/mL和0 pg/mL。CA组的IL-12和IFN-γ的表达水平均显著高于PBS组和包皮组,差异有显著性(P<0.05)。结论CA皮损组织粗提蛋白可能作为一种免疫原,增强DC的免疫功能,进而促进淋巴细胞的激活,为今后治疗CA的DC疫苗研究提供一些理论依据。
- 芦桂青程浩董乐张行沈建根
- 关键词：尖锐湿疣树突状细胞IL-12IFN-Γ
- 融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7的构建及其免疫学特性研究
- 2007年
- 目的构建融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7,并评价其体外实验和动物模型上的免疫学特性,尤其是抗病毒致病基因的特异性细胞免疫反应。方法分别构建DNA重组体pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7,pcDNA3.1-CRT180,pcDNA3.1-HPV6E7。将pcDNA3.1-HPV6E7质粒经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性细胞集落,荧光显微镜观察和RT-PCR鉴定表达HPV6E7的阳性细胞株。将质粒DNA肌注免疫C57BL/6小鼠,3次后取全血经流式细胞仪检测T细胞亚群的变化,LDH法检测小鼠的脾细胞和淋巴细胞与靶细胞B16/HPV6E7孵育后的CTL活性以及ELISA法检测共孵育上清中IL-2和IFN-γ浓度的变化。结果各组质粒经鉴定表明构建正确。转染后细胞株稳定表达HPV6E7。DNA疫苗免疫小鼠后,pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7免疫组较pcDNA3.1-HPV6E7免疫组的外周血CD8+T细胞和TCRγδT细胞的比例显著增加,脾细胞和淋巴细胞针对靶细胞B16/HPV6E7的CTL杀伤活性更明显,分泌IL-2和IFN-γ的水平升高(P<0.05)。结论CRT180与HPV致病基因6E7相连的重组质粒疫苗pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7能引发小鼠T细胞亚群CD8+分化并诱导出显著的特异性CTL反应。推测CRT180/HPV6E7DNA疫苗在动物模型上可以有效激活抗HPV特异性细胞免疫,有利于病毒感染的清除。
- 赵可佳程浩徐妍朱可建陈民利张行宋韬王琦陈大方
- 关键词：DNA疫苗免疫反应
- 表达CRT/E7融合蛋白的人乳头瘤病毒DNA疫苗对肿瘤生长和血管生成抑制作用的研究被引量：4
- 2007年
- 研究HPV6bE7／CRTDNA疫苗免疫保护，清除已有感染和相关肿瘤细胞及其血管生成抑制作用，分析CRT抗血管生成的功能片段，为筛选高效的HPV疫苗提供实验依据。用重组质粒pcDNA3．1（＋）GFP—CRT120／HPV6bE7、pcDNA3．1（＋）-GFP—HPV6bE7、pcDNA3．1（＋）GFP—CRT120、pcDNA3．1（＋）-GFP—CRT180／HPV6bE7、pcDNA3．1（＋）-GFPCRT180通过肌内注射途径免疫C57BL／6小鼠。Matrigel法进行抗血管活性检测；B16／HPV6bE7细胞接种于C57BL／6雌性小鼠建立荷瘤模型，观察各组DNA疫苗对HPV6bE7基因的荷瘤组织的出瘤时间和肿瘤大小的影响。结果显示：重组DNA疫苗pcDNA3．1-CRT180／HPV6bE7和pcDNA3．1CRT180在动物体内能对bFGF诱导的新生血管的生成有明显的抑制作用；CRT180／HPV6bE7和CRT180能显著抑制荷瘤的大小且CRT180／HPV6bE7免疫组较其他组能明显延缓荷瘤的形成时间、生长速率以及肿瘤重量。CRT180／HPV6bE7免疫组较其他组能诱导更强的血管抑制作用和部分抑制肿瘤生长，推测抑制血管的功能片段存在于CRT120～180aa片段上。
- 徐妍程浩赵可佳朱可建张行
- 关键词：人乳头瘤病毒钙网蛋白血管抑制
