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重组腺病毒介导人肝细胞生长因子在病理性瘢痕基因治疗研究中的应用被引量：9: 2003年; 采用细胞内质粒DNA同源重组方法,将人肝细胞生长因子基因构建于E1,E3区缺失的复制缺陷型5型腺病毒载体上,获得携带人肝细胞生长因子基因(HGF)的重组腺病毒Ad—HGF.在293细胞中扩增后用氯化铯密度梯度离心法扩增制备Ad—HGF和Ad—GFP(携带绿色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒),然后,用Ad—GFP和Ad—HGF体外分别转染原代培养的兔耳瘢痕成纤维细胞,观察体外转染效率及表达,并以新西兰兔耳瘢痕为体内模型,观察局部瘢痕组织中一次性注射Ad—HGF后对已形成瘢痕的治疗作用.结果显示:(i)Ad—GFP感染原代培养兔瘢痕成纤维细胞后,3 d时转染效率为(36.8±14.1)％,并持续表达20 d以上.(ii)用ELISA方法检测Ad—HGF感染原代培养兔瘢痕成纤维细胞后HGF的表达,结果感染后3 d表达量约为76 ng/4.0×105细胞.(iii)用兔耳瘢痕模型观察在瘢痕内注射不同剂量(8.6×109,8.6×108,8.6×107,8.6×106pfu)的Ad—HGF,于注射后第32天肉眼可见Ad—HGF治疗组瘢痕较治疗前明显缩小、变薄,甚至与周围皮肤在同一水平.这一效应呈剂量依赖性:大、中剂量组(8.6×109,8.6×108pfu)治疗前后瘢痕肥大指数的减少有统计学意义(P<0.05),尚可见不同程度再生的丛状新生毛,低剂量组(8.6×107,8.6×106pfu)治疗后瘢痕肥大指数有减小但无统计学意义。; 哈小琴苑宾李元敏劳妙芬吴祖泽; 关键词：病理性瘢痕创伤修复整形外科

pUDKH基因治疗犬下肢缺血后对血管、肌肉组织的影响被引量：3: 2006年; 目的：观察pUDKH（携带肝细胞生长因子基因的质粒）基因治疗犬下肢缺血后对其血管和肌肉组织病理学的影响．方法：杂种犬在静脉内注射苯巴比妥钠麻醉下，于左后侧腹股沟在股动脉由髂外动脉分支处的起始端进行全结扎，造成肢体缺血模型．模型犬被随机分为对照组和pUDKH处理组，并在结扎后即刻分别注射pUDK（空白质粒）或pUD—KH．于手术后3mo，行左髂外动脉造影术，测定股动脉血流量和下肢远端局部温度，并从被结扎的后肢股动脉及内外侧肌肉取组织标本，经常规组织病理切片染色，光学显微镜下观察．结果：3mo时血管造影pUDKH组可见明显血管网的形成，而转移空质粒的对照组仅见少量新生血管；此时转移pUDKH组犬股动脉血流量已恢复到结扎前的水平，而对照组股动脉血流量仅为结扎前的1／5～1／3；转移pUDKH组结扎侧肌肉温度与健侧相比无明显差异，而对照组两肢体肌肉温度却相差1～2℃．组织学观察对照犬可见结扎点远端股动脉塌陷，肌束间动脉管壁变厚，管腔变小甚至消失，少见新生的小血管；pUDKH处理组犬结扎点远端股动脉管腔开放，肌束间小动脉壁均普遍未见增厚，管腔亦未缩小；对照犬结扎侧肌纤维变性、断裂、肌束内水肿、脂肪性变，pUDKH处理组结扎侧的肌肉组织中上述病变不明显．结论：pUDKH的局部注射对犬下肢缺血后血管和肌肉具有保护作用．; 哈小琴赵治华吕同德李元敏任建平吴祖泽; 关键词：血管肌肉组织病理

比格犬注射重组腺病毒Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体及中和抗体的检测: 2007年; 目的:观察Beagle犬重复给予Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体及抗肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)抗体的出现时间及消失规律.方法:将24只比格犬随机分为四组:正常对照组、手术对照组、Ad-HGF小剂量组(2.4×107pfu/kg)和Ad-HGF大剂量组(2.4×108pfu/kg).Ad-HGF各组犬给予不同剂量Ad-HGF共14次.在给药2次后分别利用病毒中和反应和ELISA方法检测血清中抗腺病毒抗体和抗HGF抗体.结果:手术组、正常对照组及实验组动物于给药前及给药3次时血清细胞均未出现明显中和反应.给药4次后各剂量组动物血清均对腺病毒有不同程度中和作用,至停药后12wk抗体水平很低或已不存在.各时间点血清样品中未检测到抗HGF抗体.结论:犬肌注Ad-HGF4次后动物血清中检测到了抗腺病毒抗体,停药4wk后抗体水平有不同程度下降,直至12wk后血清中腺病毒抗体基本消失.; 哈小琴赵治华吕同德劳妙芬吴丹莉吴祖泽; 关键词：AD-HGF 中和抗体血清

肝细胞生长因子延长原代培养大鼠脊髓神经元的生存时间被引量：1: 2006年; 目的探讨肝细胞生长因子(HGF)对原代培养脊髓神经元的保护作用。方法原代培养脊髓神经元转染不同滴度的绿色荧光蛋白或肝细胞生长因子重组腺病毒(Ad-GFP or Ad-HGF),用流式细胞仪检测转染率,PI-Hoechst双染色观察神经元生长状况。用ELISA、中性红、MTT和NSE-ELISA等方法分别检测Ad-HGF转染脊髓神经元后HGF的表达,以及HGF对神经元的保护和迁移作用。结果在转染复数(MO I)为50时,Ad-GFP可高效转染脊髓神经细胞,且细胞生长状态好。转染Ad-HGF后,HGF能有效表达,同时HGF作用后的神经元活性明显高于对照组(P<0.05)。并观察到HGF对脊髓神经元有明显促迁移作用。结论HGF对体外培养的脊髓神经元有保护和迁移作用。; 刘铖阙海萍靳继德刘少君吴祖泽; 关键词：肝细胞生长因子脊髓神经元基因治疗腺病毒载体迁移

离子交换高效液相色谱法分析质粒pUDKH被引量：6: 2004年; 采用阴离子交换高效液相色谱法监测重组质粒pUDKH的生产过程和该质粒产物中超螺旋pUDKH的比例。所用的色谱条件为:色谱柱TSKgelDNA NPR(4 6mmi d ×75mm);流动相体系由20mmol/LTris HCl(pH8 8)和1mol/LNaCl组成,梯度洗脱方式。分析结果表明:质粒产物中超螺旋pUDKH含量达95%(质量分数)以上时,检测不到残留的核糖核酸(RNA)。高效液相色谱法检测质粒pUDKH产物及其生产过程的灵敏度高、试样用量少,分辨率高。; 刘佳张庆林毕建进王晓娜龚萍哈小琴王正平吴祖泽; 关键词：肝细胞生长因子超螺旋生产过程

质粒超螺旋比例对其细胞转染效率及表达的影响被引量：13: 2005年; 检测质粒开环、闭环比例不同时对其细胞转染效率及表达的影响。构建携带人肝细胞生长因子基因的质粒(pcDNA3-HGF)及携带LacZ报告基因的质粒(pcDNA3-LacZ),用核酸纯化试剂盒提取开环、闭环比例不同的质粒,然后用LipofectAMINE介导它们分别转染NIH3T3细胞,采用X-Gal染色和ELISA法分别观察转染效率和表达活性。结果表明,用超螺旋比例分别为85.45%和48.44%的质粒pcDNA3-LacZ转染生长旺盛的NIH3T3细胞,48h检测转染效率分别为23.4%±3.8%和9.3%±2.5%,前者约是后者的2.5倍。用超螺旋比例分别为93.28%和40.53%的质粒pcDNA3-HGF转染1×106NIH3T3细胞,ELISA法检测48h细胞培养上清中HGF的表达量分别为46.5±6.3ng和25.6±4.2ng,前者是后者的1.8倍。初步认为质粒开环、闭环比例不同对其细胞转染效率及表达有一定影响,超螺旋比例高时其转染效率及表达量较高。; 哈小琴吴祖泽张庆林吴彬吕同德; 关键词：质粒超螺旋转染效率

局部pUDKH基因治疗对实验性犬缺血肢体的某些生理、生化变化的影响被引量：3: 2007年; 目的探讨携带人肝细胞生长因子基因的真核表达质粒pUDKH在治疗犬肢体缺血时对其生理、生化的影响。方法建立犬左下肢血管完全闭塞性血管病模型,一次性局部肌肉注射不同剂量pUDKH,并在不同时间点检测犬生理、生化指标。结果转染pUDKH组,能使损伤的血管功能恢复,股动脉血流量恢复,脉搏搏动有力,下肢活动正常,肌电图指标无明显改变。血液生化指标在正常值范围内波动。结论局部pUDKH基因治疗犬肢体缺血后对其生理、生化无明显影响。; 哈小琴任建平吕同德张庆林毕建进吴祖泽; 关键词：基因治疗肢体缺血生理生化

经冠脉转染肝细胞生长因子促进猪梗死后心衰模型干细胞动员的研究: 2007年; 观察经冠脉转染腺病毒(adenovirus,Ad5-)携带人肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对猪心梗后心衰模型中干细胞动员的作用.12只苏中幼猪,随机分成转染Ad5-HGF组(治疗组)和转染未携带肝细胞生长因子的腺病毒载体组(mock-vector对照组),每组6只.结扎前降支制成心肌梗死模型,手术后四周行冠脉造影时给药,同时行门控心肌灌注显像评价心肌灌注及心功能情况;给药三周时,再次行门控心肌灌注显像,然后处死动物取心脏组织,酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测肝细胞生长因子蛋白表达;免疫组化检测基因转染后梗死心肌中干细胞的动员情况.经冠脉转染Ad5-HGF后心肌高度表达人HGF蛋白;治疗组心肌组织中CD117+细胞数明显多于对照组,并且同时表达c-Met;治疗组心肌血流灌注及左室射血分数(LVEF)较对照组明显改善.经冠脉转染Ad5-HGF能使心肌高度表达HGF蛋白;HGF能增加动员至缺血区的CD117+干细胞,并且该类细胞表达c-Met;HGF改善心功能及心肌灌注的作用不仅仅是血管新生,可能还涉及到对干细胞的动员召集作用.; 杨志健王伟马东超张友荣王连生张郁青徐顺霖陈波苗登顺曹克将马文珠; 关键词：基因治疗干细胞

人肝细胞生长因子基因治疗犬肢体动脉闭塞病被引量：12: 2003年; 以犬急性后肢完全缺血为模型, 观察携带人肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)基因的质粒(pUDKH)的治疗效果. 在完全结扎一侧股动脉及其分支后, 立即将不同剂量的裸露质粒 pUDKH一次性多点直接注射至结扎部位附近的局部肌肉内, 30 d时血管造影可见各剂量治疗组均有丰富的新生血管和侧枝循环的形成, 90 d时更为明显, 从而恢复了下肢远端血液供应; 而转移空质粒的对照组仅见少量新生血管. 另外, 各组在转移pUDKH后90 d时股动脉血流量均已恢复到结扎前的水平, 而转移空质粒的各组股动脉血流量恢复较慢, 仅为结扎前的1/5～1/3. 股动脉脉搏幅度测定结果也表明, 转移pUDKH的各组在90 d时脉搏幅度均得到恢复, 而对照组犬多数几乎测不到脉搏. 经比格犬长期毒性和大鼠急性毒性实验, 血液生化及病理检查未发现有转基因诱发的不良作用. 从而认为局部肌肉注射质粒pUDKH可促进犬完全缺血肢体血管的重建, 对肢体动脉闭塞病有潜在的临床治疗作用.; 哈小琴任建平毕建进张津辉张庆林吴祖泽; 关键词：肝细胞生长因子基因治疗 HGF

重组质粒pUDK-HGF的中试纯化工艺被引量：1: 2011年; pUDK-HGF是携带人肝细胞生长因子的裸质粒,目前已进入I期临床试验,因此需要大量符合药学规格的质粒DNA。文中建立了pUDK-HGF中试规模纯化制备的新工艺。流程包括:发酵、离心收获菌体、碱裂解、超滤浓缩碱裂解液、Sephacryl S-1000层析除去RNA并更换缓冲液、plasmidselect捕获超螺旋质粒DNA、琼脂糖凝胶6BFF除盐。新工艺可获得浓度为2.0 mg/mL、纯度在1.70以上的裸质粒原液,符合相关质量标准,并避免使用动物源性的酶及有毒试剂。; 胡春生王延亮卢育新程晓晨刘琳张通张庆林; 关键词：重组质粒纯化肝细胞生长因子

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国家高技术研究发展计划(2001AA217061)

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